反相高效液相色谱法测定曼地亚红豆杉中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量的研究

目的:建立测定曼地亚红豆杉中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)的反相高效液相色潜法。方法:采用硅胶层析柱(BUCHI,Φ12mm×75 mm,40～63μm),以甲醇-水(1:1)为洗脱剂对曼地亚红豆杉提取液进行初步分离制备供试品溶液;HPLC 检测条件:SHIM—PACK VP—ODS 色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm),甲醇-水(45:55)为流动相,流速为1.0 mL·min^(-1),柱温为40℃,检测波长为232 nm。结果:10-DABⅢ浓度在0.04～4.00μg·mL^(-1)范围(r=0.9974),与峰面积呈良好线性关系(n=6);回收率(n=9)为99.5%～104.9%,RSD 为1.0%～1.8%。结论:曼地亚红豆杉提取液用硅胶柱层析后,多数高含量非目标物被分离,消除了高含量非目标物对10—DABⅢ测定的影响,HPLC 检测条件简单,获得满意的效果。

南方红豆杉枝叶中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ的分离与纯化

目的:以南方红豆杉的枝叶为原料,研究其中活性成分10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)的分离和纯化条件,并进行优化筛选。方法:综合运用浸提、萃取(包括液液萃取和反萃取)、色谱分离和重结晶技术得到10- DABⅢ晶体,并采用UV,HPLC法进行分析鉴定。结果:得到了用以合成高效抗癌药紫杉醇的前体——10-DABⅢ晶体,纯度可达91%,整个工艺收率达7．9%。结论:本实验为首次采用该工艺路线得到10-DABⅢ和紫杉醇,总收率达60%以上,可用于进一步的工业化研究。

高效液相色谱法测定云南红豆杉细胞培养物中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ的含量

目的:建立云南红豆杉细胞培养物中10-脱乙酰巴卡亭III含量的测定方法。方法:样品经干燥研细后采用甲醇浸提、乙酸乙酯萃取,测定同一批细胞培养物中10-脱乙酰巴卡亭III含量,采用Spherisorb C185μm柱,流动相甲醇-乙腈-水(42∶13∶45),流速1.0ml/min,检测波长为234nm。结果:云南红豆杉细胞培养物中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量为0.023 47%,平均回收率为100.6%,变异系数(RSD)为2.2%。结论:该方法能准确、快速测定云南红豆杉细胞培养物中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量,为探讨10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ在细胞培养物中的代谢研究提供测定方法。

一种由白色类诺卡放线菌产生的新的巴卡亭ⅢC—10脱乙酰酶

紫杉醇及多烯紫杉醇是目前临床上最重要的抗癌药物，而10-DAB是半合成紫杉醇及多烯紫杉醇的前体。通过TLC监测及HPLC-MS证实，发现了一种由白色类诺卡氏菌产生的、新的巴卡亭ⅢC-10脱乙酰酶，该酶能催化巴卡亭Ⅲ生成10-DAB，酶的最适pH值和对甲醇的耐受性方面不同于已报道的巴卡亭ⅢC-10脱乙酰酶，它具有更强的底物专一性和更强的耐甲醇能力，酶的Km值为1．52mmol／L，Vmax为2．59×10^-7mmol／L·s。

南方红豆杉与引种德国曼地亚红豆杉茎、叶中紫杉醇和10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量的比较

目的：建立HPLC法同时测定并比较南方红豆杉与德国引种曼地亚红豆杉茎、叶中紫杉醇和10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量。方法采用CosmasilTMC18色谱柱（250mm×4．6mm，5μm）；以乙腈-水（50∶50）为流动相；流速为1．0mL·min-1；检测波长为227nm；柱温：30℃。结果紫杉醇、10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ的线性范围分别为2．675～42．8μg·mL-1（r＝0．9993）和3．875～62μg·mL-1（r＝0．9996），平均加样回收率（n＝9）分别为98．1％和101．6％，RSD分别为2．7％和2．3％。南方红豆杉与德国引种曼地亚红豆杉的茎、叶中紫杉醇含量分别为0．12和0．10mg·g^-1，10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量分别为0．12和0．14mg·g^-1。结论引种红豆杉与南方红豆杉在同一地区的生态环境下生长，茎、叶中所含紫杉醇和10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量有显著性差异（P＜0．05）。所建立方法准确，简便，适用于红豆杉的质量评价，为不同栽培品种的选择提供参考。

HPLC法测定东北红豆杉枝叶中10-脱乙酰巴卡亭的含量

目的 测定东北红豆杉枝叶中 10 -脱乙酰巴卡亭 (10 - deacetylbaccatin ,10 - DAB )的含量。方法 采用 RP- HPL C法。 C1 8色谱柱 (2 5 0 mm× 4 .6 mm ,5μm) ,甲醇 -乙腈 -水 (2 0∶ 30∶ 5 0 )作为流动相 ,检测波长为 2 33.9nm。结果 10 - DAB 在 0 .0 0 4 75～ 0 .0 38μg与峰面积线性关系良好 (r=0 .9990 ) ,平均回收率为 10 0 .5 % ,RSD为 2 .0 %。结论 方法操作简便、灵敏度高、专属性强 ,可用于红豆枝叶中 10 - DAB 的质量控制。

HPLC、UPLC测定南方红豆杉中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ的含量

目的:对高效液相色谱法(HPLC)和超高效液相色谱法(UPLC)测定的南方红豆杉中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)含量进行比较。方法:分别建立HPLC和UPLC测定南方红豆杉中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量的方法。HPLC法为Inertsil ODS-SP(4.6×250 mm,5μm)色谱柱,以甲醇:水(53∶47)为流动相,流速为1.0 mL·min^(-1),检测波长227 nm,柱温30℃;UPLC法为ACQUITY UPLC BEH C_(18)(2.1×100 mm,1.7μm)色谱柱,以甲醇∶水(53∶47)为流动相,流速分别为0.3 mL·min^(-1),检测波长227 nm,柱温15℃。结果:超高效液相色谱仅6.8 min即可完成测试,测定时间远低于高效液相色谱法,2种方法所得结果一致结论:UPLC法较HPLC法具有速度更快、灵敏度更高,且节省溶剂的优势。UPLC法可以成功代替HPLC法,应用于南方红豆杉药材的质量控制。

东北红豆杉枝叶中紫杉醇和10-脱乙酰巴卡亭的分离纯化及检测

目的用HPLC法对东北红豆杉枝叶中的紫杉醇和10-脱乙酰巴卡亭(10-DAB)进行分离、纯化并对其进行检测。方法采用提取的办法从红豆杉枝叶中粗提紫杉醇和10-DAB;用硅胶色谱柱对粗提物进行分离纯化并进行重结晶;用HPLC法对纯化物进行检测。结果建立了HPLC法,对紫杉醇和10-DAB进行分离、纯化及检测。结论方法简便、准确度高、重现性好。

南方红豆杉10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-乙酰转移酶基因的克隆与生物信息学分析

对中国重要药用植物南方红豆杉中的10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-乙酰转移酶(DBAT)基因进行分离、测序以及生物信息学分析。根据GenBank中已登录的10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-乙酰转移酶(DBAT)基因cDNA序列设计引物,采用RT-PCR技术从南方红豆杉叶片中克隆了1个DBAT基因Tc-DBAT的全长cDNA。结果显示,Tc-DBAT cDNA含有1个1 323 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码440个氨基酸,对应基因组序列含有1个内含子。Tc-DBAT蛋白N端含有5个N-酰基化作用位点和2个保守的N-糖基化作用位点,具有1个保守的B ig-1结构域,多个重要的磷酸化位点以及1个类似钙结合蛋白重复结构。序列同源性比较、系统发生分析以及蛋白质高级结构预测均表明,Tc-DBAT属于转移酶超家族(transferase superfamily),是一个具有乙酰转移酶活性的功能蛋白,能够催化10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DAB)10位的乙酰化,从而生成抗癌新药紫杉醇生物合成途径中的最后一个双萜中间体——巴卡亭Ⅲ。有望通过成功克隆和鉴定紫杉醇生物合成途径中的关键酶基因达到提高其半合成前体巴卡亭Ⅲ产量的目的,并且为进一步利用组合表达系统商业化生产紫杉醇奠定基础。

云南红豆杉中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ含量的固相萃取-高效液相色谱法测定

目的建立以固相萃取-高效液相色谱（HPLC）法测定云南红豆杉枝叶中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量。方法固相萃取柱：Agilent ODS C18500 mg/3 ml;色谱柱：Agilent zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm,5μm）,流动相：甲醇-水-乙腈（35∶55∶10）,流速1.0 ml.min^-1,检测波长227 nm,柱温30℃。结果 10-去乙酰巴卡亭Ⅲ在1.6-8.0μg.ml^-1范围内,进样量与色谱峰面积呈良好的线性关系,r=0.999 9,平均回收率为96.8%,RSD为4.8%（n=6）。结论该方法可用于云南红豆杉枝叶中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量测定,方法稳定,结果准确、可靠。

南方红豆杉菌根菌液体纯发酵培养产紫杉醇及10-去乙酰巴卡亭Ⅲ

从南方红豆杉菌根菌中筛选出产紫杉醇和紫杉烷类化合物10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DAB)的高产菌株,对分离获得的21株菌株进行了液体发酵培养实验,通过TLC、HPLC及LC-MS检测发现,有10株菌株具有产紫杉醇及紫杉烷类化合物的能力,其中4株菌株中产10-DAB分别为260.05、92.88、393.27、70.52μg/L,但未检出产紫杉醇;6株中产紫杉醇分别为434.94、1 242.19、200.65、360.77、317.90、29.82μg/L,但未检出产10-DAB,说明南方红豆杉的各种菌根真菌虽具有合成紫杉醇或紫杉烷类化合物的能力,但各自所合成化合物有差异,不同种类的菌根菌可能分别参与了紫杉醇生物合成的不同环节,即南方红豆杉菌根高含量紫杉醇的生物合成可能是多种菌根菌协同参与作用的结果,且其中的高产菌株具有发酵生产紫杉醇的潜力。

云南红豆杉生长过程中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量变化

目的研究云南红豆杉生长过程中不同部位10-去乙酰巴卡亭Ⅲ（10-deacetyl baccatinⅢ）的含量变化。方法采用色谱柱Agilent C18色谱柱（250 mm×4.6 mm,5μm）,流动相为甲醇-乙腈-水（42∶13∶45）,流速1.0 m l.min^-1,柱温32℃,检测波长234 nm,测定云南红豆杉生长过程中不同部位10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量。结果回归方程Y=15.290 29X-4.059 76（r=0.999 0）,线性范围5.50～550μg.ml^-1;加样回收率（n=6）98.6%,RSD为2.4%。在云南红豆杉生长期树皮中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ含量高于枝叶,是枝叶中最高含量的1.498倍;休眠芽分化期和休眠期是10-去乙酰巴卡亭Ⅲ积累的关键时期,在枝叶中的含量显著高于树皮,最高含量达0.115 0%是树皮中最高含量的1.769倍,二年生枝叶中含量略高于一年生枝叶。结论该方法简便、准确度高,可用于云南红豆杉枝叶的质量控制。

HPLC法测定云南红豆杉枝叶中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量

目的 本实验采用RP-HPLC法测定云南红豆杉枝叶中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ（10-deaxetylbaccatin Ⅲ）的含量。方法 利用C18色谱柱（250mm×4．6mm，5μm）甲醇-乙腈-水（5：35：60）作为流动相，检测波长为227nm。结果 10-去乙酰巴卡亭Ⅲ在0．096～1．947μg与峰面积线性关系良好，Y=1351．973X＋1．903（R^2=0．999），平均回收率为95．90％，RSD为1．94％。结论 此方法可靠简便、重现性好、灵敏度高，具有很高的实用价值，而且未见报导，可用于红豆杉植物中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ的定性、定量分析。

HPLC法测定南方红豆杉中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ和金松双黄酮含量

建立HPLC法同时测定南方红豆杉药材中主成分10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ和金松双黄酮的含量。采用Inertsil ODS-3 C 18(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,以甲醇-乙腈-0.1%冰醋酸为流动相,梯度洗脱,流速1.0 mL/min,柱温30℃,检测波长232 nm。研究表明10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ在0.8640~216.0μg·mL^(-1)(r=0.9999)范围内、金松双黄酮在0.8036~200.9μg·mL^(-1)(r=0.9997)范围内线性关系良好,平均加样回收率分别为99.85%(RSD=0.72%)、99.35%(RSD=0.90%)。本方法简便、准确可靠,可用于南方红豆杉药材及中药饮片的质量控制。

不同扶正方对红豆杉中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ煎出量的影响

目的：建立红豆杉水煎液中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ（10．DABⅢ）HPLC分析方法，观察不同扶正方（养阴代表方、益气代表方、温阳代表方）对红豆杉中10．DABⅢ煎出量的影响。方法：采用反相高效液相色谱法，c18色谱柱（4．61mm×250mm，5μgm），流动相为甲醇：水（40：60），流速为1mL／min，检测波长为：227Bin，柱温为25℃。结果：10-DABⅢ在20～400μg／mL范围内峰面积与含量成线性关系（Y=6．5015X4-20．792，r=0．99997），平均回收率为103．86％（RSD=1．83％）。红豆杉组、红豆杉配伍养阴代表方组、红豆杉配伍益气代表方组、红豆杉配伍温阳代表方组中10-DABⅢ的含量依次为（2．004±0．091）、（2．286±0．0734）、（2．096±0．097）、（1．640±0．138）mg（n=3）。结论：不同扶正方对红豆杉中10．DABⅢ煎出量存在明显差异，可为红豆杉临床合理使用提供参考实验依据。

从云南红豆杉细胞培养物中分离鉴定10-去乙酰巴卡亭Ⅲ

目的:从云南红豆杉(Taxus yunnanensis)细胞培养物中提取、分离和纯化10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-deacetyl baccatinⅢ,10-DABⅢ)。方法:采用固液分离、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、重结晶等方法从细胞培养物中提取分离得到10-DABⅢ,并用波谱解析(1HNMR,13CNMR)对其结构进行了鉴定。结果:建立了从红豆杉细胞培养物中提取、分离和纯化10-DABⅢ的方法,证明与从天然红豆杉植物中得到的10-DABⅢ为同一化合物。结论:本方法简便、成本低,可用于红豆杉细胞培养物中10-DABⅢ的提取、分离。

超临界CO_2—混合夹带剂萃取法提取10-脱乙酰基巴卡丁Ⅲ工艺条件研究

目的:以南方红豆杉的枝叶为原料,研究其活性成分10一脱乙酰巴卡丁Ⅲ(10-DABⅢ)提取的最佳工艺条件。方法:运用正交试验法研究萃取温度、萃取压力、萃取时间、混合夹带剂用量对CO2超临界萃取10-DABⅢ的影响。结果:最佳工艺条件为:夹带剂用量为15ml,萃取温度为50℃,压力为25MPa,时间在180min。各因素影响的强烈程度为夹带剂用量>萃取温度>压力>时间。用最佳工艺条件从南方红豆杉枝叶中提取10-DABⅢ的平均量为0.600g/kg。

CO_2超临界流体-夹带剂法从南方红豆杉中萃取10-脱乙酰巴卡丁Ⅲ的工艺条件研究

目的:研究用乙醇作夹带剂,采用CO2超临界法从南方红豆杉中萃取10-脱乙酰巴卡丁Ⅲ的最佳工艺条件;方法:采用正交试验法探讨萃取时间、压力、温度、夹带剂用量对从南方红豆杉中萃取10-脱乙酰巴卡丁Ⅲ的影响;结果:CO2超临界流体-夹带剂法从南方红豆杉中提取的10-脱乙酰巴卡丁Ⅲ的最佳工艺条件是萃取压力20MPa、萃取温度50℃、萃取时间150min、夹带剂用量为20ml/200g原料。此条件下萃取率最高可达到443.342μg/g。

培养基和培养条件对云南红豆杉细胞生长量及产生10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的影响

[目的]探讨云南红豆杉细胞生产10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的影响条件。[方法]研究不同培养基、培养温度和光照强度对云南红豆杉细胞生长量和产生10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的影响。[结果]结果表明,BTM培养基中细胞生长量和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ含量分别是B5培养基中的1.7倍和2.6倍;20℃培养时细胞生长量和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ含量分别是30℃时的1.5倍和5.7倍;暗培养细胞生长量和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ含量分别是强光照(3 000 lx)培养时的2.5倍和4.4倍。[结论]该研究结果为云南红豆杉细胞培养生产10-去乙酰巴卡亭Ⅲ提供依据。

分子模拟对接和定点突变提高10β–去乙酰巴卡亭Ⅲ乙酰氧基转移酶的活力

【目的】提高10β–去乙酰巴卡亭Ⅲ乙酰氧基转移酶(DBAT)活力,从而更高效地体外酶促合成巴卡亭Ⅲ。【方法】通过DBAT与其天然底物乙酰Co A的计算机分子模拟对接,选定C165W、N300I、F160C 3个氨基酸残基进行单点定点突变。突变基因经大肠埃希菌重组表达,突变重组酶特性经体外酶促反应测定。【结果】3种突变重组酶的相对分子质量为67 000;最适反应温度均为32.5℃,与野生酶DBAT一致;DBAT^(F160C)与DBAT的最适反应pH为7.5,略高于DBAT^(C165W)和DBAT^(N300I)的最适反应pH(7.0);DBAT^(C165W)、DBAT^(F160C)和DBAT^(N300I)的比活力与DBAT相比分别提高了61.5%、59.6%和19.2%,催化效率分别提高了55.4%、35.1%和2.9%,3种突变酶的米式常数(K_m)和最大反应速率(v_(max))均高于DBAT。【结论】疏水突变导致突变酶的比活力相比野生型均有显著提高,研究结果为体外高效酶促合成紫杉醇化学半合成的直接前体物巴卡亭Ⅲ奠定了基础。