计算机辅助设计抗MRSA耐药基因mecR1的10-23型脱氧核酶

应用Primer Premier5.0和RNA structure4.6两种软件设计和筛选有效抗mecR1的10-23型脱氧核酶(DRz),采用电转化的方法将其导入细菌体内,实时PCR的方法定量检测其对mecR1转录的影响,并通过平板克隆形成实验观察脱氧核酶抑制细菌生长的情况。结果表明,计算机辅助设计合成的5条抗MRSA耐药调控基因mecR1的10-23型脱氧核酶,它们能不同程度的降低mecR1的转录水平,有效抑制临床耐药菌MRSA080309的生长,其中DRz6抑制效果最显著。说明联合应用这两种计算机软件设计抗mecR1的10-23型脱氧核酶,是一种经济实用而有效的方法,能够大大缩短有效反义药物的筛选时间。

10-23型脱氧核酶对mRNA表达的双重抑制作用

目的:10-23型脱氧核酶是脱氧核糖核酸酶中的一种,能主动在RNA分子嘌呤-嘧啶结合点切割所有RNA分子,通过比较反义寡核苷酸的作用,初步研究10-23型脱氧核酶对基因表达抑制作用的发生机制。方法:采用体外转录GFP mRNA与脱氧核酶反应,以及GFP表达质粒与脱氧核酶共转染HeLa细胞,观察脱氧核酶对GFP的抑制作用。结果:体外和胞内实验均显示据靶点设计的10-23型脱氧核酶对绿色荧光蛋白mRNA具有切割作用。当10-23型脱氧核酶的两翼结合臂各具有连续8碱基互补而处在两翼结合臂和酶解核心连接处的2碱基错配时,尽管不能切割mRNA但是在胞内仍然有表达抑制作用;而当两翼结合臂具有4互补碱基紧接1错配碱基和4互补碱基时,10-23型脱氧核酶体外和胞内均丧失作用。结论:10-23型脱氧核酶对基因较强的表达抑制作用来自结合臂的反义寡核苷酸依赖的RNase H降解,和本身对mRNA直接切割作用的叠加,即10-23型脱氧核酶在细胞内具有对基因识别切割和诱导RNase H进行再切割的双重作用。

10-23脱氧核酶对CTX-M-38型超广谱β-内酰胺酶的抑制作用

目的:探讨10-23脱氧核酶(10-23DRz)抑制CTX-M-38型ESBLs的可行性。方法:依据CTX-M-38型ESBLs序列及其mRNA构象特征,设计针对其mRNA结构的10-23DRz脱氧核酸序列及反义核酸序列;采用氯化钙法对10-23DRz及反义核酸进行转化;依据转化菌在平板上菌落形成状况及菌液吸光度选择10-23DRz应用量;采用K-B法体外药敏试验检测耐药活性。结果:45nmol10-23DRz用量时转化菌菌落形成量及菌液吸光度较为理想。除哌拉西林、头孢噻肟及亚胺培南外,其他抗菌药物10-23DRz组与反义核酸组抑菌环直径间差异有统计学意义(P均<0.001)。结论:10-23DRz可抑制CTX-M-38型ESBLs的表达。

结核分枝杆菌ICL mRNA特异性10-23脱氧核酶切割活性的鉴定及其切割特点

为鉴定结核分枝杆菌异柠檬酸裂合梅（ICL）特异性的10-23DRz在无细胞体系切割ICL mRNA的活性，并探讨其在不同条件下以及联合应用时对靶mRNA的切割特点，采用计算机软件模拟ICL mRNA的二级结构，据此选择适合的待切割靶点并设计针对相应靶点的特异性10—23DRz（DZ1～DZ5）．PCR法扩增获得纠基因并克隆入质粒pET32a＋．采用T7 RNA聚合酶体外转录法获取ICL全长mRNA后分别用DZ1～DZ5在无细胞体系中对ICL mRNA进行切割，切割产物经变性聚丙烯酰胺凝胺电泳后用银染法鉴定各DRzs的活性．选择切割活性最强的DZ4考察不同10—23DRz剂量、不同反应时间、不同镁离子浓度条件下及不同错配或突变10—23DRz的切割特点．联合应用DZ1、DZ4及DZ5在无细胞体系中对ICL mRNA进行切割。检测10—23DRz联合应用对切割效率的影响．结果表明，DZ1、DZ3、DZ4及DZ5可在无细胞体系中有效地切割ICL mRNA，其切割效率在30．8％～64．5％之间．对DZ4切割活性的检测发现，其对靶mRNA的切割具有剂量和时间的依赖性；在2—20μmol／L范围内，DZ4的切割活性与Mg^2＋浓度呈正相关；DZ4单侧底物结合臂上含一个不与靶mRNA配对的碱基时其切割效率大大降低，两侧底物结合臂上各含一个不配对的碱基或活性中心域第6位出现碱基突变（G—C）时，DZ4完全丧失切割活性．联合应用2种或2种以上10-23DRz可显著增强对底物RNA的切割效率．10-23DRz特异、有效地切割结核分枝杆菌ICL全长mRNA并显示一定的叠加效应，有望用于抗结核分枝杆菌潜伏感染的基因治疗．

针对Egr-1mRNA的10-23脱氧核酶抑制大鼠动脉损伤后内膜增生的研究

目的探讨针对Egr-1mRNA的10-23脱氧核酶对大鼠动脉损伤后内膜增生的影响和可能的机制。方法制备大鼠颈动脉球囊损伤模型,96只大鼠随机分为4组,A组为假手术组;B组为1mmol/LMgCl2对照组;C组为FuGENE6对照组;D组为FuGENE6介导的ED5转染组;每组再按术后3,7,14和21d,分为4个亚组,每组6只。术后3、7、14、21d各处死每组动物6只,分别应用RT-PCR和Western-blot技术检测血管组织Egr-1mRNA水平及蛋白合成情况;HE染色观察损伤血管内膜的增生情况;免疫组织化学染色观察PCNA的表达。结果与B组和C组比较,D组各时间点血管内膜、中膜的厚度和管腔的狭窄率均显著减小(P<0.01);正常血管组织有微量Egr-1表达,术后Egr-1mRNA和蛋白水平逐渐增高,而D组血管组织E-gr-1mRNA和蛋白水平较B组和C组均降低(P<0.01);免疫组织化学染色显示,术后3dPCNA表达开始增加,7d达高峰,14d开始下降,D组血管壁PCNA阳性细胞百分比明显低于B组和C组(P<0.01)。B组和C组之间相比较,以上各指标差异均无显著性(P>0.05)。结论ED5可能通过抑制Egr-1和PCNA的表达,而减轻血管损伤后内膜增生。

内皮素-1 10-23脱氧核酶对离体灌流大鼠心脏急性缺血性心律失常的影响

目的 :应用内皮素 (endothelin ,ET) 110 2 3脱氧核酶抑制内源性ET 1表达 ,探讨内源性ET 1在急性缺血性心律失常发生中的作用。方法 :设计并合成ET 110 2 3脱氧核酶 ,作体外切割筛选 ;SD大鼠静脉注射ET 110 2 3脱氧核酶 ,观察心肌对 5’标记荧光素FAM的ET 110 2 3脱氧核酶的摄取和对其后离体灌流大鼠心脏左冠状动脉前降支结扎致急性缺血性心律失常的影响。结果 :设计合成的ET 110 2 3脱氧核酶在体外高效切割ET 1RNA底物 ;荧光标记ET 110 2 3脱氧核酶静脉注射 4h后 ,大鼠心肌组织内荧光广泛分布 ;静脉注射ET 110 2 3脱氧核酶4h后 ,左冠状动脉前降支结扎引起的急性缺血性心律失常显著减轻 ,并呈剂量依赖性 ,而对照序列无此效应。结论 :本实验设计的ET 110 2 3脱氧核酶能有效切割ET 1RNA ,减轻急性缺血性心律失常的发生 ,证明内源性ET 1在急性缺血性心律失常的发生中起重要作用。

10-23脱氧核酶及其应用进展

1023脱氧核酶是近年来利用体外分子进化技术筛选得到的一种具有催化功能的单链DNA片段,具有高效的催化活性及特异的序列识别能力,能催化RNA特定部位的切割反应,从mRNA水平上抑制基因表达,从而调控相应蛋白的表达,可能成为治疗肿瘤、病毒感染等疾病的新型工具。

微量热法研究10-23脱氧核酶切割反应的热动力学

选用乙型肝炎病毒(HBV)前区C/C区2031位点的序列作为底物RNA片段,并合成相应的10-23脱氧核酶,然后用微量热法研究10-23脱氧核酶的热动力学。在近生理条件下,通过微量热法测定10-23脱氧核酶切割反应的热动力学参数。根据热流曲线得出底物RNA不同浓度的反应初速率v0,再作出v-[S]曲线,通过Lineweaver-Burk作图得出10-23脱氧核酶切割反应的最大速率vmax为2.5×10-9mol/(L.s)、米氏常数Km为0.045nmol/L、催化常数Kcat为0.107min-1。

10-23脱氧核酶对新生大鼠心肌细胞ET-1 mRNA表达的影响

目的 :将体外筛选具有切割内皮素 - 1(endothelin- 1,ET- 1) m RNA的 10 - 2 3脱氧核酶转染原代培养新生大鼠心肌细胞 ,观察其对心肌细胞 ET- 1m RNA的影响。 方法 :体外转录 ET- 1全长 RNA底物 ,设计并合成 5条 ET- 110 - 2 3脱氧核酶(DZ1～ DZ5 ) ,其 5′及 3′端各有 2个核苷酸硫代修饰 ,体外切割 ET- 1RNA底物 ,筛选有效脱氧核酶 ;5′标记荧光素 FAM的10 - 2 3脱氧核酶瞬间转染新生大鼠心肌细胞以观察对 10 - 2 3脱氧核酶的摄取 ;采用半定量 RT- PCR检测 ET- 1基因的表达。结果 :DZ2、DZ3、DZ4及 DZ5在体外均可切割 RNA底物 ,其中 DZ4两侧结合区结合自由能之差最大 ,其切割效率最高 ,达83.5 % ,而 DZ3两侧结合区结合自由能之差最小 ,其切割效率亦最低 (4 7.3% ) ;瞬间转染新生大鼠心肌细胞 2 4 h,心肌细胞内可见 10 - 2 3脱氧核酶的分布 ,半定量 RT- PCR结果显示转染 2 4 h后的 DZ4 (0 .2 μmol/ L)可减少血清诱导肥大心肌细胞 ET- 1m RNA及细胞总蛋白 ,降低细胞活力与蛋白质合成速率 (P<0 .0 5 )。 结论 :本研究设计的 10 - 2 3脱氧核酶能切割体外转录的ET- 1全长 RNA底物 ,转染心肌细胞后 ,可抑制 ET- 1m RNA的表达 ,减缓血清诱导心肌细胞肥大 ,10 - 2

10-23脱氧核酶的生物催化功能研究进展

10-23脱氧核酶是利用体外筛选技术得到的一种具有催化功能的单链DNA片段,具有高效的催化活性及特异的序列识别能力,能催化RNA特定部位的切割反应,从mRNA水平上抑制基因表达,具有潜在的治疗应用价值。

10-23脱氧核酶介导的生物传感器研究进展

近20年间,DNA介导的生物传感器得到了快速的发展,DNA能够作为遗传信息重要载体的同时,其折叠成的空间构象也具有很多的功能。功能核酸的概念逐渐引入到了包括生物传感、生物成像、医疗在内的重要领域中。10-23脱氧核酶作为功能核酸的一种,是通过体外筛选技术得到的,Mg^(2+)存在的条件下能够特异性识别并切割RNA,切割位点为RNA中的嘧啶与嘌呤间的磷酸二酯键。由于其独特的识别以及切割能力,10-23脱氧核酶介导的相关疾病治疗得到了广泛的应用,同时人们逐渐开始关注10-23脱氧核酶介导的生物传感器的搭建。对于10-23脱氧核酶的结构、性质、作用方式及改进修饰进行了介绍,并对10-23脱氧核酶介导的生物传感器的搭建及应用进行了综述,旨为人们在未来使用10-23脱氧核酶搭建新型快捷生物传感器奠定理论基础。

icl mRNA特异性10-23DRz在小鼠体内抗结核分枝杆菌感染的实验研究

目的探讨iclmRNA特异性10-23脱氧核酶(deoxyribozyme,DRz)对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)在小鼠体内感染的影响,及其单独或与异烟肼(isoniazidum,INH)联合应用治疗小鼠结核病的效果。方法分别用DZ4、INH、INH+DZ4-S或INH+DZ4对Mtb进行预处理,再用上述经过预处理的Mtb感染BALB/c小鼠,一定时间后进行小鼠肺组织Mtb培养及病理学改变观察。利用DZ4-FITC溶液对BALB/c小鼠进行滴鼻处理,检测滴鼻途径给药的效果。采用尾静脉注射法建立小鼠结核病模型,将模型小鼠随机分为5组(n=10),分别给予生理盐水、DZ4、INH、INH+DZ4、INH+DZ4-polyG治疗,于治疗完成2周后进行小鼠肺组织Mtb荷菌量检测和病理学改变观察。结果Mtb感染后2周,各组小鼠的肺组织荷菌量均无显著性差异(P>0.05)。感染进行至4～12周时,INH+DZ4预处理组Mtb感染小鼠的肺组织荷菌量较其它各组均显著偏低(P<0.05),肺组织的病理改变较其他各组也明显轻微。经滴鼻途径给予DZ4-FITC溶液4h后,小鼠肺组织冰冻切片在荧光显微镜下可见强烈的黄绿色荧光,并至少持续48h。对小鼠结核病模型的治疗结果显示,DZ4单独治疗组小鼠肺组织荷菌量及病理表现与未治疗组无显著差异;加用INH治疗的各组小鼠肺组织荷菌量与生理盐水组比较有显著下降(P<0.05),肺组织病理表现也明显轻微,但10-23DRz和INH联合治疗组与INH单独治疗组在肺组织荷菌量和病理表现上均无显著性差异。结论10-23DRz与INH联合预处理可有效降低Mtb感染小鼠的能力;本研究未发现10-23DRz对结核病具有治疗作用或辅助治疗作用。

脱氧核酶在细菌研究领域的现状与展望

通过体外分子进化技术合成的具有催化活性和识别能力的单链DNA分子,称为脱氧核酶。其中10-23型脱氧核酶是应用最为广泛的脱氧核酶之一,除了在抗肿瘤、抗病毒、遗传性疾病等方面应用广泛外,近年来在细菌耐药研究领域也越来越受到关注。本文主要从10-23型脱氧核酶的结构及作用靶位的特点、切割反应的原理、设计标准与化学修饰方法及其在细菌研究领域的研究现状等几个方面进行介绍。

脱氧核酶研究进展

使用体外分子进化技术 ,从一个人工合成的随机多核苷酸单链DNA库中筛选出具有酶活性的DNA分子 ,称为脱氧核酶 .目前已经筛选出具有RNA切割作用、DNA切割作用、金属螯合作用和过氧化物酶活性、DNA激酶活性以及DNA连接酶活性等多种催化功能的脱氧核酶 .特别是脱氧核酶 10～ 2 3,无论在体外应用于RNA限制性内切酶 ,还是在生物系统内作为RNA水平上的基因失活剂 ,都具有很好的应用前景 .

10-23脱氧核酶的研究进展

10-23脱氧核酶(Deoxyribozyme,DRz)是利用体外分子进化技术筛选得到的一种具有催化功能的单链DNA片段,具有高效的催化活性及特异的序列识别能力,能催化RNA特定部位的切割反应,抑制相应蛋白的表达。本文就10-23 DRz的结构、活性影响因素、反应机制、生物特性及应用的研究进展作一综述。

10—23脱氧核酶抑制铜绿假单胞菌耐药基因VIM2作用的初步研究

目的探讨10-23脱氧核酶（DRz）抑制铜绿假单胞菌耐药基因VIM2的表达及其在逆转铜绿假单胞菌耐药中的作用。方法根据计算机模拟的VIM2 mRNA的二级结构设计合成5条VIM2特异的10-23DRz（DRzl～DRz5），在无细胞反应体系中鉴定10—23DRz对VIM2 mRNA的切割活性后，将其导入铜绿假单胞菌，利用E—test法检测亚胺培南对处理前后铜绿假单胞菌的MIC值。结果DRz3、DRz4和DRz5在无细胞反应体系中可对VIM2 mRNA进行有效切割，且其活性具有高度特异性。与对照相比，10-23DRz可以降低业胺培南对铜绿假译胞菌的MIC值。结论实验中所设计的10-23DRz能在细胞外高效特异性的切割VIM2 mRNA；在细胞内能协同亚胺培南抑制铜绿假单胞菌耐药。

构建及鉴定TACO特异性10-23DRz表达载体重组耻垢分枝杆菌

目的 构建一种可表达特异性10-23脱氧核酶（deoxyribozyme,DZ）的巨噬细胞靶向性细菌载体疫苗,并鉴定其在巨噬细胞表达10-23DZ的能力以及抑制靶基因表达的效果.方法 采用亚克隆方法将分枝杆菌复制子oriM克隆入10-23DRz真核表达载体pSDE01中,获取可在分枝杆菌和真核细胞中穿梭的重组质粒pSDE02.在前期研究基础上选择一有效的针对巨噬细胞taco基因的10-23DZ--DZ1,根据DZ1序列设计并制备DZ1的双链表达序列,插入pSDE02中获取重组质粒pDZM01.将pDZM01经电穿孔方法转化入耻垢分枝杆菌Ms1-2c株构建重组耻垢分枝杆菌rMS-DZ1.分别采用Ziehl-Heelson染色法和直接荧光观测法鉴定重组耻垢分枝杆菌的巨噬细胞靶向性.用rMS-DZ1感染巨噬细胞株RAW264.7,分别于感染后的24 h和48 h采用斑点杂交方法检测rMS-DZ1在巨噬细胞中表达DZ1的情况,再分别采取RT-PCR和免疫印迹方法检测巨噬细胞TACO表达的差异.结果 限制性内切酶酶切、菌落PCR及测序结果显示pSDE02、pDZM01和rMS-DZ1构建成功.rMS-DZ1感染RAW264.7细胞后24 h和48 h,经点杂交方法均检测到了DZ1的表达.半定量RT-PCR和免疫印迹检测结果显示,与未感染组比较,rMS-DZ1感染后24 h和48 h时巨噬细胞TACOmRNA分别下降了67.90%和57.14%,TACO蛋白水平分别下降了53.85%和68.92%.同时,表达对照寡脱氧核糖核苷酸DZ1U的重组耻垢分枝杆菌rMS-DZ1U感染RAW264.7细胞后,其TACOmRNA和TACO蛋白水平与未感染组比较均无明显差异.结论 本研究成功构建了一种可表达特异性10-23DZ的巨噬细胞靶向性重组耻垢分枝杆菌的载体,可在巨噬细胞内表达并抑制相应靶基因的表达,可作为研制治疗用疫苗的基础,这也是国内外首次报道可表达10-23DZ的细菌性载体.

CpG寡脱氧核苷酸对1型糖尿病患者外周血单个核细胞功能的影响

目的:观察CpG寡脱氧核苷酸(ODN)对1型糖尿病患者与健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-12以及IL-10表达的影响。方法:将1型糖尿病患者与健康志愿者的PBMC根据刺激物不同分为对照组、CpG组(CpGODN 2 nmol·mL-1)。用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测PBM CIFN-γmRNA、IL-12mRNA和IL-10mRNA的表达。结果:1型糖尿病患者IFN-γmRNA和IL-12mRNA的表达明显低于健康志愿者;1型糖尿病患者与健康志愿者PBMC经CpGODN刺激后,IFN-γ mRNA和IL-12mRNA的表达均高于对照组(P<0.01,P<0.01),IL-10mRNA的表达与对照组相似(P>0.05)。结论:1型糖尿病患者PBMC表达IFN-γ和IL-12下降,CpGODN可促进其表达,增强其免疫调节能力。