CFP10-ESAT6-PPE68融合基因原核表达质粒的构建和表达

目的:构建结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,M.tb)CFP10-ESAT6-PPE68融合基因原核表达质粒,并且在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法:以M.tb H37Rv株DNA作为模板,PCR法扩增ESAT6和PPE68基因,利用基因拼接技术中的Gene-SOEing法扩增ESAT6-PPE68融合基因,克隆至原核表达质粒pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-32a(+)-ESAT6-PPE68。再分别以H37Rv株DNA和重组质粒pET-32a(+)-ESAT6-PPE68为模板扩增CFP10和ESAT6-PPE68基因,Gene-SOEing法获取目的基因CFP10-ESAT6-PPE68,克隆至pET-32a(+)载体,构建重组表达质粒pET-32a(+)-CFP10-ESAT6-PPE68,转化入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。结果:CFP10-ESAT6-PPE68酶切片段大小与理论值符合,基因测序结果显示融合基因CFP10-ESAT6-PPE68的序列与Genbank中序列一致,并在大肠杆菌中成功诱导表达了目的蛋白,经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,相对分子量约为77 kD。结论:成功构建了M.tb CFP10-ESAT6-PPE68融合基因的原核表达质粒,并诱导表达出了融合蛋白,为该融合蛋白在结核病血清诊断学中的应用奠定了实验基础。

评价γ干扰素释放分析T-SPOT.TB在肺外结核病诊断中的敏感性

目的评价γ干扰素释放分析T-SPOT.TB检测在肺外结核病诊断中的敏感性。方法对北京协和医院根据细菌学或/和组织学诊断的肺外结核患者31例,应用酶联免疫斑点技术检测6kD早期分泌靶向抗原和10kD培养滤过蛋白肽段库刺激后外周血中释放γ-干扰素的特异性T细胞。结果31例肺外结核患者中29例T-SPOT.TB检测阳性,敏感性为93.5%(95%CI84.8%～100%),6kD早期分泌靶向抗原肽段库刺激后斑点形成细胞数中位数为196/106PB-MCs(4分位间距72～532/106PBMCs),10kD培养滤过蛋白肽段库刺激后斑点形成细胞数中位数为276/106PBMCs(4分位间距72～568/106PBMCs),对两个肽段库总的斑点形成细胞中位数为612/106PBMCs(4分位间距192～1152/106PBMCs)。结论T-SPOT.TB检测对肺外结核诊断具有较高的敏感性。

外周血T-SPOT.TB预测结核性胸膜炎患者病情稳定快慢的价值

目的通过分析结核性胸膜炎患者外周血结核感染T细胞斑点实验(T-SPOT.TB)与胸腔积液消失时间的相关性,探讨T-SPOT.TB在预测结核性胸膜炎患者病情稳定快慢中的价值。方法选择住院治疗并确诊为结核性胸膜炎的患者99例,采用酶联免疫斑点技术检测外周血中经6 kD早期分泌靶抗原和10 kD培养滤过蛋白刺激后释放相应γ干扰素的特异性T细胞,分别记为T-SPOT.TB评分的A值、B值。所有患者均在正规抗结核基础上行胸腔穿刺术及胸腔闭式引流术,记录胸腔积液消失所需要的时间。分析T-SPOT.TB评分与胸腔积液消失时间的相关关系。结果 99例患者中T-SPOT.TB阳性者89例,外周血T-SPOT.TB诊断结核性胸膜炎的敏感性为89.9%。T-SPOT.TB评分中A值均值为(61.3±5.2)/106PBMCs,B值均值为(74.8±3.5)/106PBMCs,A+B值均值为(136.1±3.2)/106PBMCs,胸腔积液消失时间均值为(11.7±4.2)d。A值、B值、A+B值与胸腔积液消失时间均呈正相关(r A=0.72,P A<0.001;r B=0.71,P B<0.001;r A+B=0.89,P A+B<0.001)。结论外周血T-SPOT.TB在结核性胸膜炎的诊断中具有重要价值,其评分越高,结核性胸膜炎患者胸腔积液消失时间越长,T-SPOT.TB可以作为预测及评估结核性胸膜炎患者病情稳定快慢的一个重要指标。

T-SPOT.TB检测在骨结核中的辅助诊断价值

目的评价检测外周血中结核感染T细胞斑点(T-SPOT.TB)在骨结核辅助诊断中的临床应用价值。方法回顾性分析2013-2017年内蒙古自治区人民医院和内蒙古医科大学附属医院送检的疑似骨结核的患者标本212例,其中男110例,女102例;根据临床诊断分为骨结核组111例,非结核组101例。通过检测患者外周血中的T-SPOT.TB,评价其在骨结核辅助诊断中的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值,采用ROC曲线下面积(AUC)评估T-SPOT.TB检测的诊断效能。结果T-SPOT.TB诊断骨结核的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为91.89%、63.37%、73.38%、87.67%。外周血早期分泌靶向抗原6(ESAT-6)诊断骨结核的AUC是0.8819,最佳临界值为46 SFCs/106 PBMC;外周血培养滤过蛋白10(CFP-10)诊断骨结核的AUC是0.8780,最佳临界值为34 SFCs/106 PBMC;ESAT-6+CFP-10抗原诊断骨结核的AUC是0.9110,最佳临界值是88 SFCs/106 PBMC。结论T-SPOT.TB检测可作为辅助诊断骨结核的有效方法,ESAT-6与CFP-10抗原联合检测的诊断效能优于单抗原检测。

增强ESAT6-CFP10融合蛋白诱导小鼠细胞免疫应答佐剂的筛选

目的筛选能增强特异性抗原早期分泌抗原靶6蛋白(Early secretory antigenic target 6,ESAT6)-培养滤出液蛋白-10(Culture filtrate protein 10,CFP-10)融合蛋白(E1C0)诱导小鼠细胞免疫应答的佐剂,建立基于细胞免疫应答的小鼠模型,以评价基于体外干扰素γ释放分析(IFNγrelease assay,IGRA)结核诊断方法中特异性刺激抗原E1C0的活性。方法建立小鼠IFNγ双抗体夹心SABC-ELISA检测系统,并验证系统的线性、灵敏度、重复性和特异性。将BALB/c小鼠随机分为7组:E1C0+单磷酸类脂A(Monophosphoryl lipid A,MPL)+双十八烷基二甲基溴化铵(Dimethyl dioctadecylammonium bromide,DDA)组、E1C0+DDA组、E1C0+MPL组、E1C0+弗氏不完全佐剂(IFA)组、E1C0组、生理盐水组和MPL+DDA联合组,每组6只,经小鼠后肢内侧皮下免疫3次,间隔2周,免疫剂量为:E1C0 100μg/只,MPL 25μg/只,DDA 250μg/只,IFA 100μl/只。末次免疫4周后处死小鼠,无菌取脾,分离脾淋巴细胞,加入E1C0进行培养,MTT法检测特异性淋巴细胞增殖反应,ELISA法检测培养上清中IFNγ水平。采用筛选出的最佳佐剂与抗原组合免疫3批BALB/c小鼠,进行IFNγ诱生测定。结果检测系统的线性范围为:40～2 560 pg/ml(R>0.98);灵敏度为40 pg/ml;变异系数(CV)<15%,检测大鼠、豚鼠和兔血清IFNγ均为阴性;E1C0+MPL+DDA组、E1C0+IFA组和E1C0+DDA组小鼠特异性淋巴细胞增殖刺激指数均明显高于生理盐水组(P<0.01);E1C0+MPL+DDA组小鼠的脾淋巴细胞经E1C0体外刺激后,产生的IFNγ水平明显高于其他组(P<0.001);重复试验结果显示,E1C0+MPL+DDA组3批小鼠免疫后,脾淋巴细胞诱生的IFNγ水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论 E1C0与MPL和DDA联合免疫所诱导的小鼠Th1型细胞免疫应答最强,成功建立了用于评价刺激抗原E1C0活性的小鼠模型。

结核分枝杆菌模拟抗原的筛选及初步应用

目的通过对早期分泌抗原-6(ESAT-6)及培养基滤过蛋白-10(CFP-10)肽库的结核分枝杆菌模拟抗原的筛选,旨在建立一个临床鉴别诊断结核分枝杆菌感染的新方法。方法基于蛋白ESAT-6和CFP-10的序列,随机设计合成一组19肽库,通过γ-干扰素释放试验筛选特异性结核分枝杆菌抗原模拟多肽,并研究确立其工作浓度。结果经过多轮筛选获得3条特异性模拟多肽,分别是P1MG、P8NV、P11LD,灵敏度分别为93.3%、90.0%、80.0%,特异性均>90.0%;工作浓度均为2μg/ml;将3种模拟多肽等浓度混合作为刺激原,初步临床验证试验表明,其灵敏度为95.3%,特异性为96.2%。结论基于蛋白ESAT-6和CFP-10的序列设计、筛选、制备的混合型模拟多肽抗原,有望建立一种临床结核分枝杆菌鉴别诊断的新方法。