紫穗槐-4,11-二烯合酶及其代谢工程研究进展

紫穗槐-4,11-二烯合酶催化FPP(farnesyl pyrophosphate,法尼基焦磷酸)生成青蒿素前体紫穗槐-4,11-二烯,是青蒿素生物合成途径中的关键酶。本文对紫穗槐-4,11-二烯合酶的分子生物学和代谢工程研究进行了综述。紫穗槐-4,11-二烯合酶编码基因及其相关核酸序列已经得到了克隆。紫穗槐-4,11-二烯合酶cDNA全长1641bp,编码546aa。紫穗槐-4,11-二烯合酶最适pH范围较宽,但需要二价金属离子作为辅酶才能发挥作用,其产物和底物的特异性不高。在紫穗槐-4,11-二烯合酶作用下,FPP首先进行的是1,6-合环,然后是1,10-合环,形成紫穗槐-4,11-二烯。由于紫穗槐-4,11-二烯合酶在青蒿素生物合成中具有重要的意义,自从其基因被克隆测序后,先后被导入E.coli、S.cereviseae、烟草、拟南芥和A.nidulans,获得了能产生紫穗槐-4,11-二烯的各种工程菌或细胞,研究通过不同方式提高工程菌中紫穗槐-4,11-二烯产量的方法。

紫穗槐-4,11-二烯合酶基因在酵母工程菌中具有协同作用

为了构建高产的紫穗槐-4,11-二烯酵母工程菌,主要探究了含紫穗槐-4,11-二烯合酶基因的不同表达载体在酵母工程菌中是否存在协同效应。首先构建了含紫穗槐-4,11-二烯合酶基因的酵母表达载体pGADADS,分别将pGADADS和pYeDP60/G/ADS转入酿酒酵母W303-1B和WK1中,获得6种能产生紫穗槐-4,11-二烯的酵母工程菌:W303B[pGADADS]、W303B[pYGADS]、W303B[pYGADS+pGADADS]、WK1[pGADADS]、WK1[pYGADS]和WK1[pYGADS+pGADADS]。对上述6种酵母工程菌进行发酵培养,通过GC-MS对发酵产物进行检测。结果显示,这6种酵母工程菌均能产生紫穗槐-4,11-二烯,其产率随着紫穗槐-4,11-二烯合酶基因拷贝数的增加而上升,且产生的紫穗槐-4,11-二烯对酵母工程菌没有产生毒性。导入多种ADS重组质粒后酵母工程菌的紫穗槐-4,11-二烯产率显著高于多个单质粒工程菌产生的紫穗槐-4,11-二烯之和。上述结果表明,同一宿主细胞中多种含紫穗槐-4,11-二烯合酶基因的表达载体之间存在明显的协同效应,这为构建青蒿素前体高产工程菌提供了一种思路。

缬草-4,7(11)-二烯在大肠杆菌中的生物合成

缬草-4,7(11)-二烯是一种双环倍半萜烯类化合物,具有镇静、减缓压力、抗焦虑的作用,可用来治疗注意力缺陷多动症(ADHD)等精神疾病。旨在实现缬草-4,7(11)-二烯在大肠杆菌中的从头合成,通过在大肠杆菌BL21(DE3)过表达酵母源,甲羟戊酸途径中催化乙酰辅酶A合成焦磷酸法尼基(FPP)的8个相关基因及来源于缬草属植物(Valeriana officinalis)的缬草-4,7(11)-二烯合酶(VoTPS)基因;并采用水相和有机相双相发酵的方法,通过GC-MS在有机相中检测到了缬草-4,7(11)-二烯,实现了大肠杆菌中从头合成缬草-4,7(11)-二烯。并对IPTG浓度、蛋白诱导温度和选择不同的有机相等方面进行初步优化后,确定发酵条件为:蛋白诱导温度20℃、IPTG的浓度为0.1 mmol/L,有机相为正十二烷。