LEA蛋白质11-氨基酸基序与植物抗旱性

分析了8种重要农作物第三组LEA蛋白质序列中的94个11-氨基酸基序.得出一致性序列为TAEAAKQKAGE.LEA3蛋白质中11-氨基酸基序呈多拷贝串联排列,其长度占蛋白质序列总长度的40%～60%.带电荷/极性氨基酸和疏水氨基酸数目分别占重复序列氨基酸总数的70.89%和29.11%.11-氨基酸基序的二级结构多呈α-螺旋结构.其中第1,2,4,5,9位疏水氨基酸形成螺旋蛋白质分子的疏水界面,其余位置的氨基酸形成螺旋分子的亲水界面.LEA3蛋白质全序列平均亲水指数为-0.95～-1.22.无信号肽序列.8种LEA3蛋白分子的上述特性与植物的抗旱性有关.

抗禾谷孢囊线虫基因中核苷酸结合位点区(NBS)-亮氨酸重复序列区(LRR)的克隆与序列分析

根据源于节节麦抗禾谷孢囊线虫基因Cre3及已经克隆的NBS-LRR类植物抗病基因的NBS与LRR区保守序列分别设计特异引物,从易变山羊草基因组中PCR扩增得到两个扩增条带,它们的大小分别约为530bp和1200bp.经克隆测序发现,这两个序列分别长为532bp和1175bp,且是连续的.它们有32bp的共同序列,总长为1675bp,包含了一个NBS-LRR区和一个不完整的开放阅读框,没有起始密码子、终止密码子和内含子结构.它编码一个557个氨基酸的蛋白质,分子量(Mr)为63.537×103,含有NBS区保守模体ILDD,ESKILVTTRSK,KGSPLAARTVGG,RRC-FAYCS,EGF,以及LRR区的保守模体aXXLXXLXXL.它与Cre3的核苷酸和氨基酸同源性分别为87.8%和77%,可能是一个抗禾谷孢囊线虫基因.

大豆PM2蛋白11氨基酸结构域的耐盐功能鉴定

大豆PM2蛋白属LEA3(late embryogenes is abundant group3)蛋白.以含大豆PM2基因的重组载体为模板,PCR法扩增出可编码6拷贝11-氨基酸重复序列的基因片段PM2D.构建pET28a/PM2D重组载体,并转化大肠杆菌得到重组菌BL21/PM2D.SDS-PAGE电泳结果表明,BL21/PM2D重组菌可被诱导表达相对分子质量约为15000的蛋白条带,与目的蛋白的理论相对分子质量(13600)接近.利用DNASIS软件分析,PM2D缺失短肽的亲水指数为1.12.将重组菌BL21/PM2和BL21/PM2D分别涂布在含500mmol/LNaCl和1200mmol/L山梨糖的固体培养基上,计算重组菌的存活率.结果显示,两种重组菌在含500mmol/LNaCl培养基上的存活率分别为30.8%和26.0%,均高于对照菌(BL21/pET28a)的存活率;在含1200mmol/L山梨糖培养基上的存活率分别为59.7%和59.3%,与对照BL21/pET28a菌株的存活率相比无明显差异.PM2D短肽长度为PM2蛋白全长的1/4,但BL21/PM2D重组菌的耐盐能力为BL21/PM2重组菌的80%左右.表明11-氨基酸重复序列区是PM2蛋白序列的一个耐盐结构域.

HPLC-ESI-Q-TOF-MS鉴定重组人白细胞介素-11的一级结构

用液质联用技术分析鉴定重组人白细胞介素-11(rhIL-11)的一级结构。利用电喷雾四极杆飞行时间质谱(ESI-Q-TOF-MS)测定rhIL-11的精确分子质量,采用高效液相-电喷雾四极杆飞行时间串联质谱技术(HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS)测定其胰蛋白酶酶切后肽段的部分氨基酸序列并结合数据库检索进行结构鉴定。rhIL-11的实测分子质量为19 047.38 u,与理论分子质量19 047.29 u相比非常接近。HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS测定m/z664.45、m/z609.40的肽段的部分氨基酸序列分别为Glu-Pro-Glu-Leu-Gly-Thr-Leu和Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu。将这两段序列在MASCOT数据库检索,结果表明rhIL-11的结构正确。

液质联用分析重组人白细胞介素-11的肽图

目的用液质联用技术分析鉴定重组人白细胞介素-11(rhIL-11)的肽图。方法用胰蛋白酶酶解rhIL-11,采用HPLC测定肽图,用电喷雾-四极杆-飞行时间质谱(ESI-Q-TOF/MS)技术分析肽段的精确相对分子质量,通过串联质谱(MS/MS)测定肽段的氨基酸序列。结果根据肽段的色谱保留时间、相对分子质量及对其碰撞诱导解离质谱的解析结果,归属出肽图中各肽段所在的色谱峰,已检出肽段的总覆盖率为97%。结论液质联用研究肽图是验证和分析蛋白质结构的高效准确的方法。

云南省昭通地区结核分枝杆菌临床分离株遗传多样性和耐药分子特征

目的调查云南省昭通地区结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)临床分离株的遗传多样性和耐药分子特征。方法2022年9月—2023年8月从昆明医科大学附属昭通医院收治的298例涂阳肺结核患者中共采集了MTB 298株,用MeltPro TB测定法通过荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)熔解曲线法鉴定所有分离株。用多色熔解曲线分析技术进行间隔区寡核苷酸分型(interval oligonucleotide typing,Spoligotyping)。用分枝杆菌散布重复单元(mycobcterial interspersed repetitive units,MIRU)-可变数目串联重复序列分型(variable number of tandem repeat typing,VNTR)(MIRU-VNTR)24位点分型法进行基因分型。使用PCR和靶向测序检测耐药基因突变。结果北京菌株占所有MTB菌株的69.80%(208/298)。其他谱系包括T、LAM、MANU2、CAS、NEW-1和SITVITWEB数据库中未发现的孤儿型,分别占5.70%(17/298)、3.36%(10/298)、0.67%(2/298)、0.34%(1/298)、8.39%(25/298)及11.74%(35/298)。北京菌株对左氧氟沙星的耐药率略高于非北京菌株(P=0.042),而北京菌株与非北京菌株2种基因型菌株对异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素、吡嗪酰胺、卡那霉素耐药率差异无统计学意义(P>0.05)。MIRU-VNTR 24位点分型分析结果显示,33个菌株可分为13株聚类,其聚类率为39.39%。每个等位基因的Hunter-Gaston指数在0~0.814之间,其中18个位点对非北京菌株具有中高鉴别能力。但只有10个位点对北京菌株具有中高鉴别能力。结论MTB菌株在中国云南省昭通地区表现出较高的遗传多样性,北京菌株是MTB和耐药结核病菌株的优势谱系。

苎麻细胞质雄性不育“三系”ISSR特异片段克隆和序列分析

利用ISSR分子标记技术对苎麻细胞质雄性不育"三系"mtDNA进行多态性分析;在选用的38个IS-SR引物中,有6个引物的扩增产物在不育系、保持系和恢复系之间存在差异。对这些特异性片段进行克隆和序列测定,结果表明:片段21-MS全长956bp,包含一个525bp的完整编码区,共编码174个氨基酸。片段31-M/R全长778bp,包含一个404bp的不完整编码区,共编码134个氨基酸;其核苷酸和氨基酸序列与已报道的多种植物中的番茄红素β-环化酶基因分别存在71～76和73～77的同源性。

24位点可变串联重复序列和间隔区寡核苷酸分型对河南省结核分枝杆菌基因型的鉴定

目的了解河南省结核分枝杆菌的基因型别。方法采用经典24位点分枝杆菌散在重复单元-可变串联重复序列(mycobacterium interspersed repetitive unit -variable number of tandem repeat,MIRU-VNTR)和间隔区寡核苷酸分型(spoligotyping)对2015年间河南省不同地区的668株结核分枝杆菌进行基因分型。结果间隔区寡核苷酸分型将668株菌分为11个家族,35个基因型。在558株北京家族基因型中,典型北京家族菌株546株,非典型北京家族菌株12株。在110株非北京家族菌株中,8株为新发现菌株;另102株非北京家族菌株被分为10个家族,其中T家族有76株,包括T1家族59株,T2家族7株,T3家族10株。标准24位点VNTR将668株菌分为550个基因型,有508株菌显示出单一的基因型,另160株菌被分到42个不同的基因簇中。最大簇含有21株菌,其余簇包含2~20株菌。结论河南省结核分枝杆菌主要为北京家族基因型。

中国地区丙型肝炎病毒的NS5A基因序列及干扰素敏感决定区特征分析

丙型肝炎病毒（Hepatitis Cvirus，HCV）NS5A基因编码的ISDR、PKRBD和V3等区域氨基酸序列的变异与HCV对干扰素-α（interferon—α，IFN-α）治疗的不同反应性有关，

耐碳青霉烯铜绿假单胞菌耐药机制和传播机制研究

目的阐明南方医科大学南方医院耐碳青霉烯铜绿假单胞菌的耐药机制和传播机制。方法采用聚合酶链反应(PCR)-限制性核酸片段长度多态性分析分型和测序技术对临床分离的59株耐碳青霉烯铜绿假单胞菌进行整合子Ⅰ、插入序列共同区(ISCR1)和常见碳青霉烯酶基因研究,采用肠杆菌科间重复一致性序列(ERIC)-PCR技术研究传播机制。结果 59株菌株中20株(34%)整合子Ⅰ阳性,17株(29%)整合子Ⅰ可变区阳性;9株(15%)ISCR1阳性,5株(8%)ISCR1可变区阳性且均携带qnrA1和ampR耐药基因盒。1株检出复杂性整合子Ⅰ,3株检出VIM-2基因,2株检出IMP-1基因。ERIC-PCR聚类分析在80%相似水平上聚为52个类群。结论整合子Ⅰ、ISCR1和碳青霉烯酶在铜绿假单胞菌介导多重耐药方面有重要作用,ERIC-PCR是进行铜绿假单胞菌同源性分析的有效方法。

产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌耐药机制研究

目的研究临床分离产ESBLs大肠埃希菌的耐药机制和分子流行病学情况。方法PCR检测大肠埃希菌的I类整合酶、插入序列共同区(ISCR/orf513)、产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)基因;以肠杆菌科间的重复序列(ERIC)为引物进行基因扩增,SPSS13.0分析其遗传多态性。结果102株产ESBLs的大肠埃希菌中,I类整合酶阳性菌有59株(57.8%),orf513阳性菌有6株(5.9%),ESBLs中的TEM型有91株(89.2%),SHV型有0株,CTX-M型有35株(34.3%)。根据指纹图谱,可以把102株大肠埃希菌基因型分为82种,经SPSS系统聚类分析,可归为17个大类。结论产ESBLs大肠埃希菌的整合酶阳性率较高;整合子和ISCR可以共存;ERIC-PCR是一种效果较好的基因分型方法。

X连锁无丙种球蛋白血症的基因诊断

目的研究我国X连锁无丙种球蛋白血症(XLA)患者Bruton′s酪氨酸激酶(BTK)基因的突变类型。方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),获得7例XLA患者cDNA。使用8对不同引物分2步扩增BTKcDNA,PCR产物测序。突变结果通过对DNA外显子相应部位扩增、测序证实。对其中4例母亲进行基因分析。结果7例患者的基因突变均位于BTK基因的编码区,3例在BTK的血小板-白细胞C激酶底物同源区,2例位于酪氨酸激酶区,其他2例分别位于Src同源区2和Src同源区3。突变包括:错义突变、无义突变、重复序列和片段缺失。除错义突变引起单一BTK氨基酸改变外,突变还分别造成终止密码子形成和阅读框架移位。其中4例为未见报道的新突变。进行基因分析的4例母亲中,3例为携带者。结论本组患者临床表现为典型XLA,检测出的7种突变均位于BTK基因编码区,其中4种是未见报道的新突变。XLA可以通过基因分析进行确诊以区别与其他低丙种球蛋白血症。