羊口疮病毒ORF112基因缺失毒株的构建及增殖能力分析

利用同源重组技术构建羊口疮病毒(orf virus,ORFV)ORF112基因缺失毒株,为后续研制出高效、安全的ORFV基因工程疫苗提供候选毒株。以ORF112基因为靶基因,通过重叠PCR的方法将左、右同源臂及绿色荧光蛋白(EGFP)基因表达框,进行融合后与pUC19T载体连接,构建出pUC19T-ORFV-ΔORF112-EGFP基因转移载体。将转移载体重组质粒转染到Vero细胞与WT-ORFV基因组进行同源重组。采取有限稀释法和挑取单细胞克隆法,筛选并纯化出纯合的ORFV-ΔORF112-EGFP毒株,并对该基因缺失毒株遗传稳定性和增殖特性等进行研究。结果显示:利用有限稀释和挑取单细胞克隆方法,进行阳性重组病毒纯化,通过PCR验证和测序,成功地获得ORFV-ΔORF112-EGFP重组毒株。该重组毒株在系列传代过程中EGFP稳定表达且无减弱现象。该重组ORFV-ΔORF112-EGFP毒株与野生毒株的复制生长特性基本一致。成功构建并筛选得到纯化的ORFV-ΔORF112-EGFP基因缺失毒株,该毒株具有良好的遗传稳定性和复制能力,为后续ORFV基因工程疫苗的研制提供了候选毒株。

GW112基因siRNA对人胃癌SGC-7901细胞体外增殖的影响

目的构建靶向GW112siRNA逆转录病毒载体并筛选特异高效的RNAi靶点,研究GW112基因沉默后对胃癌SGC-7901细胞体外增殖的影响。方法应用逆转录病毒载体psilencer5.1-H1Retro构建针对GW112基因3个不同靶点的RNAi干扰载体-pSiRNA-GW112(pSi405-GW112,pSi1066-GW112,pSi1480-GW112),将脂质体法转染PT67细胞包装的病毒感染SGC-7901细胞,嘌呤霉素筛选稳定克隆,RT-PCR鉴定病毒整合,Real-timePCR筛选高效抑制靶点,CCK-8法检测对细胞体外增殖的影响。Westernblot检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。结果测序结果证实各干扰靶点的重组逆转录病毒载体pSiRNA-GW112构建正确。RT-PCR结果显示除亲本细胞外,经各靶点病毒上清感染的细胞均能扩增出510bp的Puro抗性基因片段。Real-TimePCR分析表明与SGC-7901亲本细胞组相比,7901-Si405,7901-Si1066及7901-Si1480组GW112的转录水平分别只有SGC-7901组的(15.50±0.01)%,(32.40±0.01)%与(57.00±0.02)%。而7901-Sc组GW112表达基本无变化。Si405,Si1066与Si1480靶点的抑制率分别为84.5%,67.6%及43.0%。沉默GW112后导致SGC-7901细胞体外增殖能力显著抑制(P<0.05),并伴随PCNA蛋白表达下调。结论构建的重组逆转录病毒载体pSiRNA-GW112能显著抑制SGC-7901细胞的体外增殖能力,且这种增殖抑制与下调的PCNA表达有关。

GW112基因逆转录病毒载体的构建及在胃癌SGC-7901细胞的表达研究

目的构建人GW112基因的逆转录病毒载体,并通过病毒介导其在人胃癌SGC-7901细胞的稳定表达。方法采用DNA重组技术构建并鉴定重组逆转录病毒载体pLEGFP-N1-GW112;以脂质体PT67细胞包装病毒,经病毒感染的SGC-7901细胞通过G418筛选及荧光定量PCR鉴定,建立GW112稳定过表达SGC-7901细胞株。结果成功构建了pLEGFP-N1-GW112逆转录病毒表达载体,经病毒包装的重组转录病毒成功感染SGC-7901细胞,Real-Time PCR结果显示实验组中GW112基因是对照组细胞中的4.2倍。结论逆转录病毒介导的GW112基因在胃癌SGC-7901细胞获得了稳定过表达,为进一步研究GW112在胃癌中的功能奠定了良好基础。

羊传染性脓疱病毒CEV112基因的克隆与原核表达

为了克隆羊传染性脓疱病毒CEV112基因并对其进行原核表达,根据GenBank中CEV112基因序列信息设计1对引物,以CEV基因组为模板,采用PCR扩增出1条大小为867bp的CEV112基因,将其连接到pMD20-T载体上,构建pMD20-T-CEV112重组质粒,转化到大肠埃希菌(E.coli)DH5α感受态细胞中,提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建重组质粒pET28a-CEV112,转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行分析。结果表明,成功构建了pET-28a-CEV112原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达了CEV112基因,表达的融合蛋白大小约36ku,且主要以包涵体形式存在,为后续开展CEV112基因的功能研究奠定了基础。

传染性脓疱病毒112基因的原核表达及亚细胞定位

对本实验室分离的传染性脓疱病毒(ORFV)AH-F10株的112基因进行克隆、原核表达及亚细胞定位。通过PCR方法获得其112基因,并分别构建原核表达重组质粒pET-32a-112及真核表达重组质粒pEGFP-C3-112。pET-32a-112经IPTG诱导表达,获得112蛋白并制备超免疫血清。同时将pEGFP-C3-112转染BHK21细胞,观察病毒112蛋白的亚细胞定位。结果显示,pET-32a-112在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,大小约为60 ku;Western-blot结果表明,重组112蛋白具有良好的反应原性;112蛋白主要定位于细胞质中。本试验为进一步研究112蛋白的功能奠定了一定的理论基础。

白桦 BpbHLH112 基因克隆及其启动子表达特性分析

克隆白桦BpbHLH112基因的编码序列,并进行生物信息学分析。通过实时荧光定量PCR技术分析该基因在不同胁迫处理下的表达模式,进一步克隆了BpbHLH112基因上游1446 bp的启动子区域,序列分析表明,该区域含有多个逆境响应、激素响应以及信号转导等相关元件,通过构建BpbHLH112启动子片段融合GUS报告基因的表达载体并进行烟草瞬时转化,分析在不同胁迫处理条件下BpbHLH112启动子驱动GUS基因表达的活性,结果表明BpbHLH112启动子的表达能够被一些逆境胁迫因子诱导,本研究结果为深入研究BpbHLH112调控白桦应对非生物胁迫作用的分子机理提供了理论依据。

口疮病毒112基因的原核表达及生物信息学分析

为了确证口疮病毒112基因的免疫学特性,本研究参考Gen Bank载录的口疮病毒NZ2株112基因序列设计1对特异性引物,通过PCR扩增口疮病毒112全基因,连接到原核表达载体p ET-28a（＋）中,将测序正确的重组质粒命名为p ET-28a（＋）-ORFV 112,并转化到Rosetta（DE3）感受态细胞中,用IPTG进行诱导重组ORFV 112蛋白表达,并分别进行SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定,并运用生物信息学软件对口疮病毒112蛋白的性质和结构进行预测分析。结果表明,ORFV 112基因的大小约为861 bp;通过重组表达的融合蛋白大小约为40 ku;SDS-PAGE和Western-blot分析表明,该蛋白具有免疫反应原性。预测分析表明,ORFV 112蛋白分子式为C1357H2155N367O451S11,理论等电点（PI）为4.68,消光系数为23 295,脂肪指数为81.78,总平均疏水性（GRAVY）为-0.383,其二级结构主要以α-螺旋（29.37%）和无规则卷曲（40.56%）构成。本研究为深入研究口疮病毒112蛋白结构与功能及该蛋白与宿主细胞的相互作用奠定了基础。

GW112 mRNA 3’端非翻译区特异性结合蛋白研究

目的:通过体外实验筛选出与GW112 mRNA 3’非翻译区临床特异性结合蛋白,并研究蛋白性质。方法:以稳定表达GW112基因的胃癌细胞SGC-7901为实验对象,体外转录法获得GW112 mRNA 3’非翻译区片段并用生物素标记,结合亲和素磁珠特异性吸附原理,从细胞总蛋白中纯化出与GW112 mRNA 3’非翻译区特异性结合蛋白。经过质谱鉴定得到蛋白信息,并用Western blot验证结果。结果:用磁珠纯化的蛋白样品经SDS-PAGE电泳后,取目的条带进行质谱分析发现存在核仁素蛋白,以核仁素单克隆抗体进行Western blot验证后发现与质谱结果一致。结论:核仁素是GW112 mRNA 3’非翻译区特异性结合蛋白的一种,并很可能对GW112 mRNA稳定性有直接影响,这为进一步揭示GW112在胃癌细胞抗凋亡机制中的作用奠定基础。

一例ABO新等位基因B112的分子生物学研究及其家系分析

目的 研究1例新的ABO亚型B112的分子机制,并对其家系进行分析.方法 应用单克隆抗体检测先证者红细胞ABO血型抗原,标准A、B、O红细胞检测先证者血清中的ABO抗体.采用聚合酶链反应（po1ymerase chain reaction,PCR）技术扩增先证者ABO基因的第5至7外显子序列,PCR产物经双酶切后直接测序分析第6和7外显子.同时采用基因组单链抽提技术分离先证者的两条单倍型,对分离的单倍型扩增后进行ABO基因测序分析.家系调查采集先证者父母的标本进行ABO血清学实验和ABO基因第6和7外显子测序分析.结果 先证者血清学表型符合B表型特性,直接测序分析显示第6和7外显子有261G/缺失、297A/G、526C/G、559C/T、657C/T、703G/A、796C/A、803G/C、930G/A杂合,推断基因型为BO.基因组单链抽提技术将先证者B和O基因分离后,测序得到两个等位基因为O01和B112.与B101相比,B112第559位C→T导致第187位精氨酸变成半胱氨酸.家系调查显示先证者B112基因从母亲遗传所得,母亲标本ABO血型血清学特性和测序分析结果与先证者完全一致.结论 发现1例559C＞T突变的ABO亚型新等位基因B112,其B抗原表达正常,提示α-1,3-半乳糖基转移酶第187位精氨酸变成半胱氨酸并不影响B转移酶的活性.