幽门螺杆菌基因克隆表达及其抗原表位分析

目的克隆表达幽门螺杆菌基因hp0410,构建12肽噬菌体展示库,对hp0410的抗原表位进行筛选和分析,为构建多表位嵌合疫苗提供理论依据。方法从幽门螺杆菌NCTC11639基因组DNA中扩增出hp0410,并克隆入pGEX-4T-1中表达。利用纯化重组蛋白筛选出特异性单抗E018,利用该单抗和M13噬菌体12肽随机肽库,构建HP0410抗原表位的抗原展示库。竞争-抑制实验验证获得的阳性噬菌体并测序,生物信息学分析HP0410的抗原表位。结果成功构建可高水平分泌型表达HP0410的原核表达系统。对13株阳性噬菌体测序后获得8个表位,其中候选表位1个。HP0410可有效抑制展示该表位的噬菌体与单抗E018结合。分析表明,获得的8个表位与HP0410同源性不高,但处于生物信息学预测的区域。结论获得8个HP0410高抗原性区域的模拟表位,其中1个为模拟单抗E018特异性结合的抗原决定基的候选表位。

鸡DEC-205结合肽的筛选及体外鉴定

为筛选鸡DEC-205的优势结合肽,以小鼠CD8α信号肽、鸡DEC-205具有结合作用的3个C型凝集素样结构域(CTLD-4、CTLD-5和CTLD-6)、人IgG1 Fc和His标签作为目的基因,设计构建重组表达质粒pcDNA3.1-DEC-205-Fc-his和pcDNA3.1-Fc-his(用于对照);转染293t细胞,Western blot鉴定蛋白表达;镍亲和层析法纯化蛋白,用于噬菌体线性12肽库筛选结合肽,protein G/A交替进行了3轮液相淘选,对第3轮噬斑提取DNA测序并统计肽重复率。对重复率较高的短肽进行合成,ELISA及荧光显微镜观察鉴定肽与重组蛋白的结合效果。Western blot结果显示,转染重组质粒的293t细胞裂解液和细胞上清均可表达目的蛋白,DEC-205-Fc-his蛋白约90 kDa, Fc-his蛋白约35 kDa,与预期大小符合,纯化的蛋白作为靶标进行3轮淘选后,15条序列出现重复,其中DLPVNSVIFPFR(DL)重复率最高(达到6.41%)。ELISA及荧光检测结果显示,合成的DL短肽可结合表达DEC-205-Fc-his的细胞,与表达Fc-his的细胞亲和性较低。筛选获得的DL短肽经体外鉴定,结果显示是鸡DEC-205的潜在配体,相关结果将为研发鸡DEC-205新型靶向策略奠定基础。

生殖支原体黏附蛋白MgPa特异结合多肽的筛选与鉴定

目的：利用噬菌体展示随机12肽库筛选生殖支原体黏附蛋白（ MgPa）的特异结合多肽，以了解MgPa的生物学功能及其可能的致病机制。方法以纯化的重组生殖支原体黏附蛋白（ rMgPa）为靶分子，对噬菌体展示随机12肽库进行3轮生物淘选，收集淘选后的噬菌体进行扩增培养，利用碘化钠法提取其单链DNA进行测序分析。用ELISA、竞争性结合试验和斑点免疫印迹试验检测阳性噬菌体与rMgPa结合的特异性。结果进行3轮生物淘选后，噬菌体克隆有明显富集。随机挑取的38个噬菌体克隆中，共出现11种不同的外源性多肽序列（ P1~P11）。根据11条多肽序列中氨基酸出现的重复次数，推导出两条核心序列，即：V-H-W-D-F-R-Q-W-W-Q-P-S和D-W-S-S-W-V-H/Y-R-D-P-Q-T/S。 ELISA、竞争性结合试验和斑点免疫印迹试验的结果表明：11个代表性克隆中，有10个（P1~P10）能与rMgPa发生特异结合。结论成功筛选到了能与rMgPa发生特异结合的2条多肽，为了解MgPa的生物学功能，从而进一步了解Mg可能的致病机制提供前期实验基础。