基于抗原表位预测的MUC1模拟肽表位筛选

目的:预测粘蛋白1(Mucin1,MUC1)抗原的B细胞表位,从噬菌体随机多肽文库筛选及鉴定MUC1抗原的模拟表位。方法:对MUC1的二级结构及免疫原性进行分析,预测MUC1的抗原表位。利用纯化获得的Ma695抗体筛选噬菌体随机12肽库,夹心ELISA分析噬菌体克隆,测定阳性克隆DNA序列,竞争性抑制实验鉴定阳性噬菌体克隆。结果:MUC1存在有17个潜在的抗原表位区域。经3轮筛选,获得了14个阳性克隆,DNA序列分析并推导出其氨基酸序列:KHYDPFHHRMPQ,QADTARSVALAG,VPSKPDLHVRSI及MTPIHYWNHNRV;4个噬菌体展示肽克隆抑制率均在50%以上。结论:预测MUC1抗原B细胞表位,为进一步研究MUC1结构和功能奠定了基础。所得序列KHYDPFHHRMPQ,QADTARSVALAG,VPSKPDLHVRSI及MTPIHYWNHNRV能模拟MUC1抗原表位。

P-糖蛋白结合肽的筛选及合成肽鉴定

目的筛选人膀胱癌P-糖蛋白特异性结合肽并合成鉴定。方法利用表达获得的P-糖蛋白胞外段融合蛋白为靶蛋白,采用酶联板法筛选噬菌体随机12肽库,化学合成该特异性肽序列,免疫细胞化学方法进行鉴定。结果从噬菌体随机肽库中筛选获得了与P-糖蛋白特异性结合的噬菌体阳性克隆,测序获得特异性结合肽序列。免疫细胞化学结果显示特异性合成肽可与耐药细胞BIU-87/ADM结合,而与敏感细胞BIU-87不结合。结论筛选获得的结合肽具有一定的亲和力,可与特定的肿瘤细胞结合,表现出一定的肿瘤特异性;P-糖蛋白结合肽的筛选,为人膀胱癌多药耐药的靶向治疗结论提供实验依据。

人泌尿系上皮肿瘤疫苗的初步研究

目的通过筛选噬菌体随机12肽库获得MUC1糖链抗原模拟表位。方法利用纯化获得的M a695抗体筛选噬菌体随机12肽库,通过夹心ELISA分析噬菌体克隆,测定阳性克隆DNA序列并进行同源性及氨基酸分析,竞争性抑制实验鉴定噬菌体克隆。结果经3轮筛选,获得了14个阳性克隆,DNA序列分析并推导出氨基酸序列:KHYDPFHHRMPQ,QADTARSVALAG,VPSKPDLHVRSI,MTPIHYWNHNRV。鉴定结果表明4个噬菌体展示肽克隆抑制率均在50%以上。结论所得序列KHYDPFH-HRMPQ,QADTARSVALAG,VPSKPDLHVRSI,及MTPIHYWNHNRV模拟了MUC1抗原表位。

有机磷农药广谱抗原表位多肽的制备及应用

利用噬菌体展示技术,以广谱型单克隆抗体筛选十二肽噬菌体展示库,获得能够模拟有机磷类农药抗原表位的十二肽,建立了一种间接竞争ELISA方法用于检测多种有机磷类农药。结果表明,获得的特异性多肽氨基酸序列为HPAPDHSSQSHQ,呈现出较好的抗原性、亲水性及表面可及性,可广谱模拟有机磷农药抗原表位。所建立的间接ELISA方法对有机磷农药通用结构半抗原(BPB)的IC50和IC10分别为1.776μg/ml及0.358μg/ml,与对硫磷、蝇毒磷、乙拌磷、辛硫磷、喹硫磷和三唑磷的交叉反应率分别为58.74%、44.93%、52.03%、43.98%、36.82%和4.87%。建立的检测方法具有绿色、广谱、高效的特点,是一种新型有机磷类农药累积毒性检测技术。

乳腺癌原代细胞特异性多肽的筛选

目的利用噬菌体展示技术从噬菌体随机十二肽库中筛选出能够特异性结合乳腺癌原代细胞的噬菌体多肽。方法以乳腺正常细胞为减性筛选细胞、乳腺癌原代细胞为靶细胞,对从商业购买的噬菌体随机十二肽库进行筛选,选取富集后的单克隆噬菌体,ELISA鉴定阳性噬菌体的特异性及亲和力,扩增阳性噬菌体克隆并提取DNA,测序后进行比对。结果经过3轮筛选,噬菌体得到近100倍富集,随机挑选11株单克隆噬菌体,ELISA鉴定显示2号噬菌体对乳腺癌细胞具有较高特异性及亲和力,测序结果显示其表达的多肽序列为未知序列。结论利用噬菌体筛选技术成功筛选出能够特异性结合乳腺癌原代细胞的特异性多肽,为进一步合成多肽应用于靶向治疗乳腺癌奠定基础。

禽传染性支气管炎病毒N蛋白保守B细胞抗原表位的鉴定

应用噬菌体随机十二肽库技术对针对IBV GX-YL5株N蛋白的单抗N2D5进行抗原表位的鉴定。将淘选得到的噬菌体随机十二肽库第3轮洗脱液进行二代测序,将测序结果中出现频率最高的3个十二肽序列合成肽后验证是否为模拟表位;根据获得的模拟表位预测相应的天然表位序列并合成多肽和原核表达进行验证,同时对获得的天然表位进行保守性和交叉反应性分析。结果显示,第3轮筛选洗脱液测序出现频率最高的3个序列中有2个为模拟表位,即VVGRAMAYSTIP和DGVLLGTSGEST;预测天然表位序列为158IPLNRGRGGRST169;预测天然表位的合成肽的ELISA和Dot-blotting分析以及其原核表达蛋白的Western-blotting分析表明,158IPLNRGRGGRST169是IBV的一个天然表位序列;保守性和交叉反应性分析显示该天然表位具有高度保守性。结果表明,本研究成功鉴定出IBV GX-YL5 N蛋白上的一个高度保守的表位158IPLNRGRGGRST169,为IBV N蛋白的抗原结构和功能的研究及诊断试剂和表位疫苗的研制奠定了基础。

噬菌体随机肽库技术筛选抗CCR5单克隆抗体的识别表位

目的利用噬菌体随机肽库技术筛选趋化因子受体5(CCchemokine receptor 5,CCR5)单克隆抗体的识别表位。方法用抗CCR5单克隆抗体筛选噬菌体随机12肽库,采用双抗体夹心ELISA法鉴定噬菌体阳性克隆,挑取阳性克隆测定DNA序列,推导其氨基酸序列并进行同源性分析。结果从噬菌体随机12肽库中筛选出30株可与抗CCR5单抗特异结合的噬菌体克隆,其中多数克隆呈现核心序列HY-TC-SS-XX-P/FYS-X,该序列与CCR5的一级序列ECL2具有一定的同源性。结论 HY-TC-SS-XX-P/FYS-X序列是抗CCR5单抗的识别表位。

乳腺癌干细胞富集及其特异性多肽的筛选

目的:无血清培养法富集乳腺癌干细胞(breast cancer stem cell,BCSC)并采用噬菌体展示技术,筛选能特异性结合乳腺癌干细胞的噬菌体多肽。方法:无血清培养法富集乳腺癌MDA-MB-231细胞株中干细胞并以此为靶标,以hs578bst人正常乳腺细胞及普通培养的MDA-MB-231细胞为减性筛选细胞,对噬菌体随机肽库进行双重减性筛选,选取富集后的阳性噬菌体单克隆,ELISA及DAB染色鉴定阳性噬菌体特异性并测序。结果:经过3轮筛选,噬菌体得到约500倍的富集,随机挑选10株单克隆噬菌体。ELISA显示,6号噬菌体单克隆对乳腺癌干细胞的亲和力是对照的6.14倍;DAB鉴定亦显示,其对乳腺癌干细胞的特异性及亲和力最高,对阳性噬菌体DNA测序翻译得到十二肽氨基酸为GYSASRSTIPGK。结论:通过干细胞富集及噬菌体展示技术,成功筛选出能够特异性结合乳腺癌干细胞的特异性噬菌体多肽,为乳腺癌的干细胞靶向治疗和深入研究奠定基础。