柽柳再生和转化体系的建立及瞬时转化TcSYP121基因功能分析

【目的】建立柽柳再生及遗传转化体系并分析瞬时转化柳树突触融合蛋白(TcSYP121)基因功能,为筛选柽柳分子抗性育种候选基因及盐碱土的改良和生态修复提供理论参考。【方法】通过单因素筛选最佳外植体、消毒处理、各阶段(初代、分化、增殖和生根)的培养基类型及激素浓度建立柽柳再生体系;通过正交试验分析影响转化体系的4个因素(预培养时间、侵染时间、共培养时间和农杆菌浓度);通过PCR扩增及电泳结果验证柽柳转化体系;瞬时转化TcSYP121基因获得过表达植株(OE)和病毒诱导的基因沉默植株(VI),进行表型观测、植物超氧阴离子染色液(NBT)和二氨基联苯胺法(DAB)染色并测定盐腺直径和盐腺密度、叶绿素含量、超氧化物酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性及TcSYP121基因相对表达量,分析TcSYP121基因的功能。【结果】最优外植体为柽柳嫩茎段,最适宜次氯酸钠(NaClO)消毒浓度为5%,最佳消毒时间为5 min,最适合的初代培养基为MS培养基,最佳分化培养基为MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA,最佳增殖培养基为MS+1.5mg/L6-BA+0.1mg/LIBA,最佳生根培养基是1/2MS+0.5mg/L IBA。转化体系中正交试验结果为最佳预培养时间是2 d,最佳侵染时间是5 min,最佳共培养时间是2 d,最佳农杆菌浓度OD600为0.8,抗生素头孢霉素(Cef)浓度为300 mg/L,卡那霉素(Kan)筛选压为30 mg/L。PCR扩增及电泳结果显示,利用该遗传转化体系可获得阳性转基因植株。瞬时转化TcSYP121基因柽柳的耐盐功能分析结果显示,在盐胁迫下,VI和对照(CK)柽柳中叶绿素含量显著下降(P<0.05),而OE下降不显著(P>0.05);OE柽柳SOD和POD活性均高于VI与CK,且OE中Tc SYP121基因的相对表达量高于CK和VI。【结论】建立了柽柳的再生体系和遗传转化体系,通过对柽柳进行瞬时转化获得过表达和沉默表达柽柳,证实TcSYP121基因能够提高柽柳耐盐性。

甘蓝BobHLH121基因克隆、亚细胞定位及表达分析

【目的】克隆甘蓝b HLH转录因子(BobHLH121)基因,分析其在不同组织及低温胁迫下的表达模式,为深入研究bHLH转录因子在甘蓝低温响应中的作用机理提供理论参考。【方法】克隆BobHLH121基因编码区(CDS)序列,利用生物信息学软件进行预测分析,并构建p CAMBIA1300-FaFKF1-GFP融合表达载体,通过农杆菌介导转染烟草表皮细胞,观察荧光信号以确定蛋白亚细胞定位情况。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测BobHLH121基因在低温胁迫下的相对表达量。【结果】BobHLH121基因CDS长度为1367 bp,定位于C06染色体上,其编码311个氨基酸,蛋白分子量为34.89 kD,理论等电点(p I)为5.42,不稳定系数为52.29,疏水性平均系数为-0.733,说明该蛋白为不稳定的亲水性蛋白,且呈酸性,定位于细胞核。BobHLH121蛋白的二级结构主要由α-螺旋(占30.87%)、延伸链(占9.32%)、β-转角(占2.89%)和无规则卷曲(占56.91%)组成,具有保守的HLH结构域。BobHLH121蛋白与拟南芥(NP_191768.2)、琴叶拟南芥(EFH52923.1)、亚麻荠(XP_01909381.1)、荠菜(XP_023638997.1)、油菜(CDY65446.1)、白菜(XP_009104362.1)和萝卜(XP_018442860.1)等多种植物bHLH蛋白的氨基酸相似性分别为55.6%、54.8%、52.0%、50.3%、76.4%、73.9%和61.1%。系统发育进化树分析结果显示,BobHLH121与拟南芥(NP_191768.2)和琴叶拟南芥(EFH52923.1)bHLH蛋白在同一小分支上。BobHLH121基因启动子区域存在植物生长发育、非生物胁迫、激素应答和光响应大量的顺式作用元件。BobHLH121基因在叶片的相对表达量显著高于其他组织(P<0.05,下同),在其他组织中的相对表达量均较低。低温胁迫6~12 h时BobHLH121基因的相对表达量较低温处理0 h(对照)显著降低,在低温处理24 h时急剧升高,显著高于其他处理时间,低温处理48 h时又显著降低,表明该基因可能在低温胁迫下延迟表达。【结论】BobHLH121基因含有bHLH家族典型的HLH保守结构域序列,具有明显的组织表达特异性,可能参与甘蓝叶片的生长发育调控,且响应低温胁迫,可能在甘蓝耐寒性中发挥调控作用。

人血管内皮细胞生长因子121基因修饰材料修复桡骨火器性骨缺损

背景:骨缺损是导致火器性股损伤骨不连的首要原因,火器性损伤相对比较特殊。自体骨移植和异体骨移植均存在较大弊端,难以满足基层医院需求,采用具有良好血管能力、骨能力的组织工程化骨修复火器性骨缺损将是一种理想的、可行的修复方法。目的:探讨人血管内皮细胞生长因子121基因修饰材料在兔桡骨火器性骨缺损修复中的应用。方法:将128只家兔随机分为手术致伤组和火器伤组,每组64只。火器伤组采用56式滑膛枪发射质量为0.25 g的钢珠,建立火器伤桡骨损伤模型;手术致伤组仅用手术方法造成兔桡骨1.2 cm损伤模型。采用人血管内皮细胞生长因子121基因修饰材料进行修复处理,取家兔相关组织细胞,获得骨髓基质干细胞进行培养,制备多孔支架材料,并将获得的材料分别植入手术致伤组和火器伤组家兔桡骨骨缺损部位,分析人血管内皮细胞生长因子121基因修饰材料在兔桡骨火器性骨缺损修复中的应用。结果与结论:与手术致伤组相比,修复8,12,16周后,火器伤组家兔骨缺损部位灰度比值、健侧与修复侧桡骨的抗压缩力学比值降低(P<0.05),新生骨面积增多(P<0.05);修复2,4周后,骨缺损修复处局部血流量显著升高(P<0.05)。结果说明,与单纯手术致桡骨损伤相比,烧伤致桡骨损伤修复过程中由于局部出现了缺血缺氧,采用人血管内皮细胞生长因子121基因治疗效果更理想。人血管内皮细胞生长因子121能够对骨髓基质细胞进行修复,将其运用于火器烧伤中能够提高其合成及分泌成血管因子,提高其局部血流量、降低抗压缩力学比值,且新生骨面积较大。

羊口疮病毒安徽株121基因的原核表达与生物信息学分析

为了对羊口疮病毒(ORFV)安徽株121基因进行原核表达及生物信息学分析。以ORFV AH-F10株为模板对121基因进行PCR扩增,将扩增产物克隆至pGEX-6P-1原核表达载体,构建重组质粒pGEX-6P-1-121,并进行测序鉴定。经鉴定正确后的重组质粒转化至E.coli Rosetta感受态细胞进行IPTG诱导表达,并对重组蛋白的诱导条件进行优化,确定了ORFV 121重组蛋白表达的最佳条件。SDS-PAGE及Western-blot鉴定结果表明,重组蛋白大小约为60 ku,在Rosetta中高效表达,主要以包涵体形式存在且具有良好的反应原性。包涵体蛋白经过纯化后得到目的蛋白,将纯化蛋白与弗氏佐剂进行乳化后皮下注射6周龄的BALB/c雌鼠。每14 d后加强免疫1次,4次后收集小鼠血清。对收集到的血清进行Western-blot特异性鉴定,该抗体血清可以和阳性原核表达的ORFV 121蛋白进行特异性反应,表明成功制备鼠源多抗血清。利用生物信息学相关软件对目的基因编码蛋白的理化性质、信号肽、跨膜结构域、磷酸化位点、二级结构和B细胞表位进行预测。结果显示该蛋白等电点为8.86,属不稳定的亲水性蛋白;预测有50个可能的磷酸化位点,无信号肽和跨膜结构域;二级结构中以无规则卷曲结构居多占62.25%,α-螺旋、β-转角、延伸链分别占27.81%,2.98%,6.95%;预测该蛋白存在8个潜在B细胞优势表位。成功表达了ORFV AH-F10121蛋白并预测其生物学特性,为该蛋白结构与功能及ORFV致病机理的深入研究奠定基础。

人类TMEM121基因的生物信息学分析

目的:以人类心肌特异性表达基因TMEM121为研究部对象,对其编码蛋白的结构和功能进行预测。方法:利用生物信息学方法对TMEM121蛋白的同源度、二级结构、互作蛋白及功能等进行预测分析。结果:TMEM121蛋白在进化上高度保守,与猩猩、绿猴、家猫、大鼠及小鼠等的同源度高达96%以上,主要二级结构是α螺旋,无信号肽,定位于内质网的可能性比较大,具有转运及信号转导等功能。结论:人类TMEM121基因可能作为转运和信号转导因子与其他蛋白共同作用参与成体心脏功能的调控。

血管内皮生长因子121和骨形态蛋白2双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定

背景:人血管内皮生长因子121和骨形态蛋白2在激素性股骨头坏死骨缺损中均具有成血管成骨作用,目前国内在以人血管内皮生长因子121和骨形态蛋白2基因联合治疗激素性股骨头坏死方面少有报道。目的:构建人血管内皮生长因子121与人骨形态发生蛋白2双基因腺病毒穿梭质粒。方法:将质粒pShuttle-CMV-VEGF121-IRES-hrGFP-1经KpnⅠ/XbaⅠ酶切后,将BMP2片段定向连入pShuttle-CMV-VEGF121-IRES,构建可同时表达2个目的基因重组质粒pShuttle-CMV-VEGF121-IRES-BMP2,注入H5a细胞扩增,铺板,筛选阳性菌落,提取质粒,进行酶切分析及序列测定。将已构建确认正确的腺病毒质粒,经BJ5183-AD-1电转感受态细胞进行电穿孔后,铺板,筛选阳性菌落,提取质粒,进行酶切分析,PCR检测和序列分析。结果与结论:酶切分析及核酸序列测定证实重组质粒构建正确,提示实验成功构建了血管内皮生长121及骨形态蛋白2双基因共表达重组腺病毒载体。

人类TMEM121基因的生物信息学分析

【摘要】目的人类TMEM121基因是一个在心脏的胚胎和成体期均有高表达的基因，尽管该基因已被克隆十余年，但其生物学功能迄今仍是一片空白。方法本研究利用生物信息学方法和工具对人类TMEM121蛋白的理化性质、二级结构、亲／疏水性、互作蛋白及功能等进行预测分析。结果显示TMEM121蛋白在进化上高度保守，与猩猩、绿猴、家猫、大鼠及小鼠等的同源度高达96％以上，d螺旋是构成该蛋白二级结构的主要元件，无信号肽，定位于内质网的可能性比较大，具有转运及信号转导等功能。结论人类TMEM121基因可能作为转运和信号转导因子与其他蛋白共同作用参与成体心脏功能的调控。

山羊痘病毒疫苗株和野毒株ORF121基因比较分析

山羊痘(goat pox,GP)是由山羊痘病毒(goat poxvirus,GPV)感染引起山羊的一种烈性传染病,弱毒疫苗接种是预防和控制GP的重要手段之一。ORF121是GPV编码和GPV转录、复制及细胞内包装相关的基因之一,在GPV突破宿主细胞免疫系统过程中扮演重要角色。为比较分析GPV疫苗弱毒株和野毒株编码的ORF121基因特征,本研究扩增并测定了GPV疫苗株和野毒株的ORF121基因序列,比较分析了二者核酸水平和氨基酸水平的变异及其蛋白质二、三级结构差异。结果表明,GPV疫苗弱毒株和野毒株编码的ORF121基因核苷酸序列相似性为97.9%,氨基酸序列相似性为98.2%。本研究结果为揭示GPV异原宿主致弱的机制积累了资料。

PC-1基因K121Q多态性与2型糖尿病合并冠状动脉粥样硬化性心脏病的关系

目的观察PC-1基因K121Q多态性与2型糖尿病合并冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称2型糖尿病合并冠心病)的关系。方法选自2018年1月-2020年1月于我院医院收治的2型糖尿病合并冠心病患者120例作为观察组,健康体检者103例作为对照组。观察两组间生化学指标、基因型及等位型基因频率,并对比观察组PC-1不同基因型的血脂及血糖水平。结果对照组总胆固醇、三酰甘油、LDL-C、HbAlc、空腹血糖、cTnⅠ、apoCⅢ、BMI均低于观察组,而HDL-L则高于观察组(P<0.05);对照组KQ+QQ基因及Q等位基因低于观察组,KK、K等位基因高于观察组(P<0.05);观察组PC-1基因K121Q位点KK与KQ+QQ基因型间比较,KK基因型BMI低于KQ+QQ基因型,差异显著(P<0.05);而两基因型患者空腹血糖、总胆固醇、三酰甘油、LDL-C、HDL-L水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论PC-1基因K121Q多态性可能通过影响血脂、血糖代谢,进而导致2型糖尿病合并冠心病的发生。