载^(125)I标记三螺旋形成寡核苷酸纳米粒的制备及初步应用

目的构建载^(125)I标记反雄激素受体(AR)基因三螺旋形成寡核苷酸(^(125)I-TFO)纳米粒,并初步探讨其在体外对前列腺癌细胞的抑制作用。方法应用Bolton-Hunter法对三螺旋形成寡核苷酸进行^(125)I标记,通过复乳化溶剂挥发法制备包载^(125)I-TFO的纳米粒(^(125)I-TFO-NP),测定其粒径、形态、包封率、载药量及体外释放特点。用γ计数器测定前列腺癌细胞LNCa P对^(125)I-TFO-NP的摄取情况,CCK-8法检测纳米粒对前列腺癌细胞增殖的抑制作用、荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法检测纳米粒中AR mRNA表达水平。结果所获^(125)I-TFO的标记率和放射化学纯度分别为(86.87±0.45)%、(96.21%±0.97)%。^(125)I-TFO-NP的平均粒径为(298.2±0.5)nm,包封率与载药量分别为(70.6±6.6)%和(1.89±0.13)μg/mg,缓释作用明显。前列腺癌细胞对^(125)I-TFO-NP的摄取率高于未包裹^(125)I-TFO(P<0.01)。与空白对照组及TFO-NP组比较,^(125)I-TFO-NP组中前列腺癌细胞的增殖抑制率升高(P<0.01),AR mRNA及蛋白表达水平均下降(P<0.05)。结论制备的载^(125)I-TFO-NP性状良好,可通过下调AR的表达水平,抑制前列腺癌细胞的增殖。纳米粒可为反基因放射治疗提供理想的载体。

^(125)I标记三螺旋形成寡核苷酸及其对肝癌细胞杀伤力研究

目的探讨三链形成寡核苷酸(TFO)的125I标记方法及其对肝癌细胞的抑制作用。方法合成一段能与HBV前S基因特异结合的TFO,并用125I标记;以HepG2.2.15细胞为靶细胞,分125I-TFO、等量TFO、相同活度125I、空白对照四组分别转染细胞,以MTT比色试验检测各组细胞存活率。结果①125I-TFO的标记率为93%,放化纯为99%,比活度129.6 kBq/ug,体外稳定。②125I-TFO组的细胞杀伤率高于其它组(P<0.05),最高抑制率为35.2%。结论Iodogen法标记连接酪胺的寡核苷酸的方法简便、标记率和放化纯高,标记产物生物活性损失小,体外稳定性好;标记化合物有效抑制了肝癌细胞生长。

^(125)碘标记三链形成寡核苷酸对肝癌细胞中病毒复制和细胞生长的抑制作用

目的探讨125碘(I)标记三链形成寡核苷酸(TFO)与乙型肝炎病毒(HBV)DNA的特异性结合能力及其对肝癌细胞HepG2.2.15中病毒复制及细胞生长的抑制作用。方法合成能与HBV前S基因特异结合的TFO,并以125I标记。将HepG2.2.15细胞分别与125I-TFO实验组(125I-TFO组)、等量TFO对照组(TFO组)、相同放射性活度的钠125碘(Na125I)组和空白对照组共同培养,荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞培养液中HBVDNA拷贝量变化,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测转染后各组细胞的存活率。结果RT-PCR显示转染48h后,4组间病毒拷贝数量的差异有统计学意义(P<0.01),125I-TFO组对病毒复制的抑制作用显著强于空白对照组(P<0.01)、125I对照组(P<0.01)和TFO组(P<0.01);TFO组的抑制病毒复制作用显著强于空白对照组(P<0.05)。转染24、48、72h,125I-TFO组对HepG2.2.15细胞的生长抑制作用显著高于其他3组(P值均<0.01),并随时间的增加125I-TFO对细胞生长的抑制作用呈线性上升趋势。结论125I-TFO可有效地抑制肝癌细胞中HBV的复制及肝癌细胞的生长,为今后制备抗HBV、抗HBV相关肝细胞癌的放射性基因治疗药物奠定了基础。

雄激素受体三螺旋形成寡核苷酸抗前列腺癌细胞增殖的研究

目的 探讨反基因策略对雄激素受体(AR)表达和前列腺癌细胞增殖的影响。方法 针对AR基因2 4 4 7～2 4 6 1核苷酸序列设计并合成三螺旋形成寡核苷酸(TFO) ,经脂质体介导转染LN CaP前列腺癌细胞株,于转染后2 4、4 8、72h分别采用3H 胸腺嘧啶核苷(TdR)参入实验测定癌细胞增殖活性,用逆转录聚合酶链反应(RT PCR)方法检测ARmRNA表达,用放射配基结合分析法(RBA)单点法检测AR蛋白质表达,并与反义寡核苷酸(ASON)相比较。结果 2 4、4 8、72hTFO组LNCaP细胞的AR表达水平明显低于ASON组(P <0 0 5 ) ,TFO对LNCaP细胞增殖的抑制率显著高于ASON(P <0 0 5 )。结论 该TFO能有效抑制AR表达和前列腺癌细胞增殖。

人工诱导双链断裂(DSB)与三螺旋形成寡核苷酸(TFO)在提高基因打靶效率中的应用

基因打靶技术是研究基因功能的重要手段,而基因打靶效率特别是体细胞的打靶效率非常低下。人工诱导双链断裂(DSB)与三螺旋形成寡核苷酸(TFO)是目前正在研究的提高打靶效率的方法。文中综述了这2种方法的基本原理、设计思路及在提高基因打靶效率中的应用,并对2种方法的特点进行了分析比较,最后对其未来发展进行了展望。

反基因及反义寡核苷酸体外抗前列腺癌作用的研究

目的探讨三螺旋形成寡核苷酸(TFO)和反义寡核苷酸(ASO)对前列腺癌细胞雄激素受体(AR)表达和细胞增殖的影响。方法设计并合成针对AR基因的TFO和ASO,经脂质体介导转染前列腺癌细胞株LNCaP。MTT法检测细胞增殖活性,RTPCR检测AR基因表达,免疫组化法检测AR蛋白表达,放射免疫分析检测PSA表达。结果转染后24、48、72h,TFO组LNCaP细胞ARmRNA平均表达水平分别为0.25、0.33、0.46,显著低于ASO组的0.44、0.54、0.60,P<0.05;TFO对LNCaP细胞的生长抑制率(51.8%、65.8%、36.2%)显著高于ASO(28.8%、42.6%、17.5%),P<0.05。TFO对AR蛋白表达的抑制作用强于ASO。转染后24hPSA表达水平[(0.5±0.1)ng/ml]显著低于ASO组[(0.8±0.2)ng/ml],P<0.05。结论在LNCaP细胞TFO对AR表达和癌细胞增殖的抑制作用明显强于ASO,反基因策略对于前列腺癌的治疗具有重要研究价值。

抗乙型肝炎病毒基因治疗的若干进展

随着分子生物学特别是基因工程技术的发展 ,抗乙型肝炎病毒基因治疗有较深入的研究 ,利用基因重组、转基因及反义核酸等技术 ,在细胞水平或通过动物实验阶段的研究 ,基因有关治疗在抗乙肝病毒、抑制乙肝病毒复制中的作用已被证实。本文对转基因干扰素、DNA疫苗 (DNA免疫 )、反义寡核苷酸、三螺旋形成寡核苷酸 (反基因寡核苷酸 )。

卟啉锰-TFO-吖啶的合成

目的 合成卟啉锰 TFO 吖啶化合物。方法 合成含 7 去氮 2 脱氧黄嘌呤的TFO ;以吖啶修饰TFO的 3′末端 ,以 6碳氨基连接臂修饰TFO的 5′末端 ;四苯基卟啉四羧酸经金属化、酯化后 ,与TFO的 5′末端偶联 ;薄层层析纯化 ,质谱、紫外光光谱分析鉴定。结果 薄层层析结果显示在对照寡核苷酸带前方有一条淡黄色的吖啶 TFO带 ;紫外光光谱分析显示卟啉锰 TFO 吖啶化合物同时具有 2 60nm处寡核苷酸的特征吸收峰和 468nm处卟啉锰的特征吸收峰。质谱分析结果证实 ,卟啉锰 TFO 吖啶化合物分子量实测值与理论值一致。结论 合成了卟啉锰 TFO

乙型肝炎病毒(HBV)反基因与HBV的结合及对HBV复制的影响

目的 研究三螺旋形成寡核苷酸与ＨＢＶ基因的结合情况及其对ＨＢＶ复制的影响。方法 合成一段能与ＨＢＶ核心启动子位点（１７３４～１７５３ｎｔ）形成三螺旋的寡核苷酸（ＴＦＯ２０）并标记上生物素，分别用脂质体－ＴＦＯ２０及裸ＴＦＯ２０转染ＨｅｐＧ２．２．１５细胞，用链酶亲和素－生物素法（ＳＡＢＣ）检测其转染效率及其与ＨｅｐＧ２．２．１５细胞中ＨＢＶ ＤＮＡ的结合情况；并采用ＥＬＩＳＡ、半定量逆转录（ＲＴ）－ＰＣＲ及荧光定量ＰＣＲ法分别检测经寡核苷酸处理的ＨｅｐＧ２．２． １５细胞及空白对照细胞上清ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢＶ ＤＮＡ及细胞中ＨＢＶ ＲＮＡ的水平。结果 脂质体－ＴＦＯ２０转染ＨｅｐＧ２．２．１５细胞的效率可达８０％，而裸ＴＦＯ２０转染率最高为４０％；ＴＦＯ２０主要定位于细胞核及胞浆中。ＴＦＯ２０处理组细胞上清中ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ含量分别较空白对照组降低３７．０％及７８．２％，ＨＢＶ ＤＮＡ水平较空白对照组明显降低；而细胞中２．４ｋｂ／２．１ｋｂ ＲＮＡ、３．５ ｋｈ／３．４ ｋｂ ＲＮＡ亦分别降低３１．６％及７０．２％。结论 ＴＦＯ２０通过脂质体包裹后可以很好地进入细胞并与ＨＢＶ ＤＮＡ结合；ＴＦＯ２０能?