5-溴脱氧尿嘧啶核苷体外标记肌源性干细胞:最佳浓度及时间

背景:肌源性干细胞移植入动物体内可以修复骨、肌肉、软骨或神经系统的损伤,但要了解其在体内的迁移、增殖及分化的情况,还需要一种有效、安全的标记方法来追踪其在体内的变化。目的:观察5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记肌源性干细胞的效果,探讨其最佳标记浓度和时间。方法:采用差速贴壁法体外分离SD大鼠肌源性干细胞,免疫细胞化学染色法鉴定第2代细胞并进行细胞计数。以终浓度5,10,15,20μmol/L的5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记肌源性干细胞,检测其最佳标记浓度,免疫细胞化学染色法分析其标记率;通过MTT法、锥虫蓝排斥实验观察5-溴脱氧尿嘧啶核苷对细胞增殖的影响。结果与结论:免疫细胞化学染色显示肌源性干细胞呈Desmin阳性,阳性率为(85.7±6.0)%;经5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记的肌源性干细胞与未进行标记细胞在活力和增殖上相比未见明显差异(P>0.05),标记后的肌源性干细胞活细胞率可达(92.3±2.1)%。其中浓度为10,15,20μmol/L标记组标记效果均优于5μmol/L标记组,10μmol/L为最佳工作浓度,最佳标记时间为3d,标记率为(70.9±4.5)%,随时间延长无明显变化。证实应用5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记肌源性干细胞后,对细胞的活力及增殖情况无影响,标记率也能达到细胞移植对其示踪的要求。

5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷标记大鼠骨髓间充质干细胞的有效性

背景:深入准确地研究骨髓间充质干细胞在体内外增殖、分化的规律,寻找安全、有效、灵敏度高、特异性强、简便的标记活细胞的方法至关重要。目的:探索5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞的有效性及对其增殖能力的影响。方法:全骨髓贴壁法培养扩增SD大鼠骨髓间充质干细胞至第3代。将细胞以5×107L-1浓度接种于96孔板中,掺入法加入终浓度为0,10,20,50μmol/L5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷,分别在培养24,48和72h检测5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷标记细胞的阳性率、标记后的细胞形态,并绘制标记细胞的生长曲线。结果与结论:各浓度组标记率均随标记时间延长而升高(P<0.05);各时间点标记率随标记浓度的升高而增加,但其差别无显著性意义(P>0.05)。10μmol/L5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶标记骨髓间充质干细胞72h即可获得良好的标记率。标记前后各组间充质干细胞生长曲线均呈"S"形。说明在实验浓度范围内应用5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷体外标记骨髓间充质干细胞有效,不影响细胞的增殖,且10μmol/L5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞72h即可获得良好的标记率。

^(125)I-脱氧尿嘧啶核苷对肺癌细胞A549的杀伤作用

目的探讨125I-脱氧尿嘧啶核苷(125I-UdR)对体外培养的A549肺癌细胞的杀伤作用及其影响因素。方法测定A549肺癌细胞在含有不同浓度125I-UdR的RPMI 1640培养液中培养48 h后细胞及细胞核摄取125I-UdR的量;测定肺癌细胞A549及脐静脉内皮细胞(ECV304)在含有100 kBq/ml 125I-UdR的RPMI 1640培养液中培养2～48 h后不同时间细胞摄取125 I-UdR的量;用细胞克隆形成法评价不同浓度125 I-UdR对A549肺癌细胞的杀伤作用。结果 A549细胞和细胞核摄取125I-UdR的量随培养基中125I-UdR浓度增加而增加;在含有100 kBq/ml浓度125 I-UdR的培养液中,随培养时间的延长A549细胞和细胞核摄取125 I-UdR的量增加。在不同培养时间下,A549细胞摄取125I-UdR的量在各时间点均明显高于ECV304细胞的摄取量。细胞存活分数随培养基中125I-UdR浓度增加呈递减趋势。结论 125I-UdR能够被A549肺癌细胞摄取,并快速进入细胞核内,且摄取量存在浓度依赖性和时间依赖性1,25I-UdR对肺癌细胞具有明显的杀伤作用。

5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记在喉黏膜干细胞的研究

目的以5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine,5-BrdU)为标记对小鼠喉黏膜可能存在干细胞进行初步研究。方法选取出生3 d的昆明小鼠36只,随机分为A、B和C组,每组12只。A组小鼠皮下注射100μg/g的5-BrdU,B组小鼠皮下注射50μg/g的5-BrdU,C组小鼠皮下注射生理盐水。第8周后分别处死各组小鼠,并取小鼠喉黏膜进行免疫组化检测,计算其标记滞留细胞的阳性率。结果 8周后,注射了5-BrdU的A组与B组小鼠喉黏膜鳞状上皮有标记滞留细胞表达但两组间表达无统计学意义(t=0.06,P=0.949)。C组小鼠喉黏膜鳞状上皮无标记滞留细胞表达。结论 A、B两组小鼠喉黏膜存在标记滞留细胞,此标记滞留细胞具有喉黏膜成体干细胞的一些特点,可能是成体干细胞的来源。

^(125)I-脱氧尿嘧啶核苷瘤内注射治疗人膀胱癌的动物实验研究

目的研究125I-脱氧尿嘧啶核苷(125I-UdR)在荷人膀胱癌裸鼠移植瘤模型中的应用效果和安全性,为125I-UdR临床应用提供实验依据。方法荷人膀胱癌裸鼠移植瘤瘤内注射相对合适剂量(123.33 MBq/kg)的125I-UdR,通过肿瘤生长抑制率、肿瘤病理及电镜改变以及γ计数仪测量各脏器放射性活度来分析其疗效和安全性。结果荷人膀胱癌裸鼠移植瘤二次瘤内注射相对合适剂量的125I-UdR,肿瘤体积缩小明显,病理示坏死彻底(核消失),电镜见核溶解、消失。外周血常规及肝肾功能无明显变化,正常组织无明显病理改变。结论荷人膀胱癌裸鼠二次瘤内注射125I-UdR(123.33 MBq/kg)是安全有效的。

溴脱氧尿嘧啶核苷掺入标记口腔肿瘤的研究

目的 :观察和探讨非放射性核素 溴脱氧尿嘧啶核苷 (BrdU)标记在口腔肿瘤增殖研究中的价值。方法 :用 80 μg/ml的BrdU体外掺入舌癌细胞或舌癌组织 ,标本连续切片与增殖细胞核抗原 (PCNA)表达比较 ;相同孵育时间的细胞与流式细胞术 (FCM)定量S期细胞数比较。结果 :BrdU标记细胞核大浑圆 ,呈散在或姊妹细胞分布 ,子代细胞染色稍淡。BrdU掺入和PCNA表达之间无显著性差异 (P >0 0 5 )。FCM测定的S期细胞数显著多于BrdU掺入的细胞数 (P <0 0 0 1)。结论 :BrdU标记可用于口腔肿瘤细胞增殖研究 ,其应用潜力较大。

5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记法检测哺乳动物体细胞染色体异常分离的研究

通过分析5-溴脱氧尿嘧啶核者(Brdu)掺入后第2周期细胞染色体，同步评估了受试物秋火仙素(COL)及昆明山海棠(THH)水抽提物在小鼠骨髓细胞中的有丝分裂阻滞、染色体异常分离及姐妹染色单体互换(SCE)诱发效应，Brdu—琼脂包埋法标记动物后1h．腹腔注射COL(1—2mg／kg)，THH(2.5—10g/kg，

细胞核标记物5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷的研究及应用进展

细胞移植疗法是现代医学发展最为迅速的领域之一。采用干细胞治疗技术修复退变的椎间盘．是治疗早中期椎间盘退变的理想方法。为了解细胞移植后在体内的存活、迁徙、分布和转归等情况，需要依赖合适的示踪技术将细胞加以标记．以进行识别和监测。

溴脱氧尿嘧啶核苷体外掺入舌癌的初步研究

目的 :观察溴脱氧尿嘧啶核苷 (BrdU)标记在肿瘤增殖研究中的价值。方法 :用 80 μg ml的BrdU或碘脱氧尿嘧啶核苷 (IdU)体外掺入Tca8113细胞或舌癌组织 ,标本连续切片与增殖细胞核抗原 (PCNA)表达比较 ;相同孵育时间的细胞与流式细胞术 (FCM)定量S期细胞数比较。结果 :BrdU标记细胞核大浑圆 ,呈散在或姊妹细胞分布 ,子代细胞染色稍淡。BrdU或IdU掺入和PCNA表达之间无显著性差异 (P >0 0 5 )。FCM测定的S期细胞数显著多于BrdU掺入的细胞数 (P <0 0 0 1)。结论 :BrdU标记可用于细胞增殖研究 。

间接标记假尿嘧啶核苷方法的研究

本文报告了固相标记假尿嘧啶核苷方法。用苯乙酸作偶联剂 ,以巯基树脂为载体 ,利用硫与汞的高效率结合 ,对假尿嘧啶核苷进行间接标记 (I12 5)。最后采用高压液相色谱分离 ,标记率为 40～ 5 0 %

^(125)I脱氧嘧啶核苷内照射治疗肝癌的实验研究

目的评价瘤内注射125I脱氧嘧啶核苷(UdR)对大鼠肝癌的治疗效果。方法制备Wistar大鼠肝癌动物模型后,于瘤内注射125I UdR,第14 d光镜及电镜检查肿瘤组织的病理变化,观察生物的生存期,同时检测第2次给药后7 d、14 d以上指标的变化。结果瘤内注射125I UdR后第14 d治疗组光镜和电镜检查发现局部肿瘤组织呈轻度坏死表现。治疗组I载瘤大鼠的生存时间延长,平均生存期为49.6±6.6 d,与对照组大鼠的平均生存期(25±5.3 d)相比有显著性差异(P<0.05)。治疗组Ⅱ局部肿瘤组织呈中度坏死表现,大鼠的生存期为64.5±8.5d,与单次给药相比有显著性意义(P<0.05)。结论瘤内注射125I UdR对肝癌移植瘤动物有显著的治疗效果,二次注射125I UdR后,增强了对肿瘤的杀伤作用。

^(125)I-UdR瘤内注射治疗Lewis肺癌荷瘤小鼠效果观察

目的研究125I标记脱氧尿嘧啶核苷(125I-UdR)在Lewis肺癌荷瘤小鼠模型治疗中的药物分布、用药安全性和治疗效果。方法在Lewis肺癌荷瘤小鼠模型瘤内注射125I-UdR(3.7 MBq/10μL),通过γ-计数器测量各脏器放射性活度和SPECT显像来观察125I-UdR的药物分布;分析用药后外周血象、肝肾功能等指标及骨髓象来评价125I-UdR的安全性;观察用药后瘤体的组织细胞学变化并作生存分析。结果125I-UdR局部注射后可在瘤内持续浓聚并致肿瘤细胞坏死;其外周血象、肝肾功能和骨髓象无明显变化,接受治疗的荷瘤鼠生存期明显延长。结论荷瘤鼠瘤内注射125I-UdR治疗Lewis肺癌安全有效。

^(125)IUdR对人脑胶质瘤细胞SHG44的杀伤作用

为评价12 5IUdR对人脑胶质瘤细胞SHG4 4的杀伤作用 ,把12 5IUdR加入到SHG4 4细胞的培养基中 ,孵育后测量细胞摄取12 5IUdR的放射性活度 ;采用克隆形成法测定12 5IUdR对SHG4 4细胞生长抑制的效果。结果表明 ,培养基中12 5IUdR浓度增加时 ,SHG4 4细胞对12 5IUdR的摄取量也相应增加 (相关系数r =0 .9917)。SHG4 4细胞摄取12 5IUdR后生长受到明显抑制 ,细胞存活分数与培养基中12 5IUdR浓度呈直线负相关 (r =- 0 .9736 ) ,其半数致死剂量LD50 为 (8.7± 0 .12 )kBq/mL ,12 5IUdR组的SHG4 4细胞存活分数明显低于Na12 5I组 (P <0 .0 0 1)。结果提示 ,12 5IUdR能够掺入到SHG4 4细胞中 ,12 5IUdR对SHG4 4细胞有明显的杀伤作用 ,说明12 5IUdR可望成为治疗脑胶质瘤的潜在的一种放射性药物。

大鼠膀胱内灌注^(125)I脱氧尿嘧啶核苷的药代动力学及组织分布

目的探讨125I-脱氧尿嘧啶核苷(125I-UdR)在大鼠膀胱内灌注后药代动力学及组织分布情况。方法将8只SD大鼠随机分成2组,每组4只。A组每只大鼠单纯125I-UdR(7.5MBq/kg体重)膀胱内灌注给药,B组每只大鼠单纯125I-UdR(7.5MBq/kg体重)经尾静脉注射给药。连续采集血液,用γ计数仪测定其放射性;12只SD大鼠随机分为3组,每组4只。每只膀胱内灌注125I-UdR1.5MBq,经0.5、2、24h后分组处死,取相关脏器后测量放射性计数。结果膀胱灌注125I-UdR后的大鼠体内代谢符合二房室分布模型,按化学剂量100μg/kg体重灌注后测得,平均T1/2α为3.34h,T1/2β为36.78h,Cmax为0.54μg/L,Tmax为1.72h。静脉注射125I-UdR后的大鼠体内代谢符合一房室分布模型,按化学剂量100μg/kg体重静注后测得,平均T1/2为0.09h,Cmax为14.55μg/L,Tmax为0.00h,膀胱灌注的绝对生物利用度F为38.46%。膀胱灌注后125I-UdR主要分布在大鼠膀胱,肝脏,脾脏中。结论125I-UdR用于膀胱灌注可以提高局部组织药物浓度,延长其在靶器官的滞留时间,并可减少对周围组织的毒副作用。

BrdU作为脂肪干细胞标记示踪法的可行性

目的:研究BrdU标记猪脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的最佳剂量及时间,探讨其作为干细胞标记示踪方法的可行性.方法:自中华实验猪背部提取脂肪组织,采用贴壁法分离培养ADSCs,取第3代细胞以终浓度分别为10、15、20、25及30μmol/LBrdU进行标记;另一孔不含BrdU作为对照组,分别培养12、24、48、72及96h.免疫荧光法检测各组细胞BrdU标记率,找出BrdU的最佳标记方法,通过台盼蓝排斥试验、MTT及细胞凋亡检测,观察BrdU对ADSCs生长情况的影响.对第3代的ADSCs采用最佳标记方法后更换普通培养基继续培养,适时传代,连续检测第4、5、6、7、8代ADSCs的BrdU标记率.结果:原代培养的ADSCs的形态主要为长梭形,第3代ADSCs经BrdU标记后胞核呈红色荧光,随浓度的升高及时间的延长,BrdU阳性标记率逐渐升高,以终浓度20μmol/LBrdU标记48h后阳性率达90%以上,且连续传5代标记率仍达40%.MTT、台盼蓝排斥试验及细胞凋亡检测发现BrdU对ADSCs生长增殖基本无影响.结论:BrdU标记ADSCs的最佳剂量和时间为20μmol/L和48h,该方法标记率高,对细胞影响小,可用于动态研究ADSCs在移植体内生长、分化.

^(125)I放射性粒子组织间植入治疗人胰腺癌裸鼠移植瘤的有效性研究

目的探讨125I放射性粒子组织间植入治疗人胰腺癌裸鼠移植瘤的疗效及其作用机制。方法人胰腺癌SW1990细胞株接种于BABL/c裸鼠右下肢旁腹股沟区偏背侧皮下,成瘤后取瘤块接种,6周后成瘤8～10mm。共16只成瘤大小合适的裸鼠用于实验,分别植入125I粒子(8只)和空载粒子(8只)。粒子植入后,每4天测量肿瘤的长径和短径并称裸鼠体重,裸鼠处死后称量瘤体重。瘤体标本行组织病理学检查、末端脱氧核苷酸转移酶-生物素dUTP切口末端标记法(TUNEL)检测凋亡细胞及免疫组化染色检测增殖细胞核抗原。结果 125I粒子治疗组肿瘤体积增长缓慢,而对照组肿瘤体积增长迅速。实验组和对照组瘤体重分别约(2.68±0.70)g和(4.68±1.45)g,两者的差异有统计学意义(P=0.021);抑瘤率约42.66%。粒子植入前、后实验组和对照组间裸鼠体重对比差异无统计学意义(P>0.05)。治疗组肿瘤细胞坏死明显,而对照组肿瘤细胞无明显或仅有少许坏死。TUENL法检查发现实验组和对照组的凋亡指数分别为(23.2±1.9)%和(8.1±1.5)%,两者的差异有统计学意义(P<0.01)。免疫组化染色发现:实验组及对照组增殖细胞核抗原(PCNA)阳性染色指数分别为(49.8±1.8)%和(82.2±2.4)%,两者的差异有统计学意义(P<0.01)。裸鼠心、肝、肺、肾及脾脏等组织无明显放射性炎症表现。结论 125I粒子组织间植入治疗人胰腺癌裸鼠移植瘤是有效的,其作用机制包括:直接杀伤肿瘤细胞、诱导肿瘤细胞凋亡及降低细胞增殖,并且125I粒子植入瘤体内对周围脏器是安全的。

不同浓度5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记山羊骨髓基质干细胞的体外研究

目的利用5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记山羊骨髓基质干细胞（BMSCs），检测其最佳标记浓度、时间及细胞毒性，探讨其作为山羊BMSCs标记及示踪方法的可行性。方法抽取10个月龄健康中国青山羊骨髓，贴壁培养并鉴定。以浓度分别为5、10、15和20μmol／L的BrdU标记第4代细胞，分别记为A、B、C、D组；未用BrdU标记的细胞作为空白对照组（E组）。分别标记12、24、48和72h后，免疫荧光法检测各组标记阳性率，锥虫蓝拒染法检测标记后细胞存活率。结果原代及传代培养的山羊BMSCs形态主要为梭形，经诱导后能向成骨细胞和软骨细胞分化。标记后，荧光显微镜下胞核呈绿色荧光。随着标记时间和浓度的增加，各实验组标记阳性率逐渐增高，于15μmlol／L孵育48h后，其标记率可达到（93．32±3．25）％，与15μmol／L孵育72h和20μmol／L孵育48、72h差异无统计学意义（P〉0．05），与其他各组各时间点差异有统计学意义（P〈0．05）；各时间点空白对照组标记阳性率均为0。锥虫蓝拒染实验示各组细胞存活率均在90％以上，差异无统计学意义（P〉0．05）。结论BrdU浓度为15μmol／L，标记时间为48h时，对山羊BMSCs可得到最佳的标记效果，且安全性较高。

^(125)I-UdR的小鼠体内分布

本工作研究了 12 5I- Ud R(脱氧尿嘧啶核酸 )在正常与荷瘤裸鼠动物模型 (L OVO型结肠癌、小细胞肺癌和宫颈癌 )中的生物分布。实验结果表明 :12 5I- Ud R在几种荷瘤裸鼠动物模型中的生物分布表现不同 。