南方红豆杉紫杉烷13α-羟化酶基因的克隆及序列分析

目的:紫杉烷13α-羟化酶是紫杉醇下游合成途径关键酶之一,负责催化紫杉二烯-5α-醇的C13侧链发生羟基化反应生成紫杉二烯-5α、13α-二醇。该研究从南方红豆杉中克隆出紫杉烷13α-羟化酶基因并对其序列进行生物信息学分析。方法:利用南方红豆杉的总DNA和总RNA为模板,采用PCR和RT-PCR技术克隆出紫杉烷13α-羟化酶基因的DNA序列和cDNA序列,利用swiss-prot、DNAMAN等生物信息学工具对其核酸序列和蛋白序列进行分析。结果:测序结果显示其cDNA序列长度为1 651bp,含有一个1 458bp的开放阅读框,同源性比较分析结果表明,其氨基酸序列与已经报道的蔓地亚红豆杉的紫杉烷13α-羟化酶氨基酸序列的一致性为96%。结论:成功克隆出南方红豆杉紫杉烷13α-羟化酶基因,为利用合成生物学工程技术生产紫杉醇或其前体物质提供了分子基础。

海南粗榧紫杉烷13α-羟化酶基因的克隆及实时定量表达分析

本研究利用RACE技术从海南粗榧（Cephalataxus mannii）中克隆出紫杉烷13α-羟化酶基因。该基因含有一个1 488 bp长的开放阅读框（ORF）,可编码495个氨基酸,该序列所编码氨基酸属于P450蛋白超家族系统,存在明显的疏水峰,含有线粒体靶向肽。进化树分析显示,该基因所编码的蛋白与紫杉醇合成途径中6种酰基转移酶来自同一个祖先,其中与紫杉烷13α-羟基化酶基因同源性最高,属于同一进化分支。实时荧光定量表达分析表明,紫杉烷13α-羟化酶基因在被茉莉酸甲酯（MeJA）诱导后的海南粗榧中表达量变化显著,处理后0~12 h目的基因表达量变化不明显,12~24 h目的基因表达量剧增,达到最大值,形成明显波峰。结果表明紫杉醇的合成可能与植物体抵御逆境胁迫存在重要关联。

紫杉醇的生物合成:紫杉烷13α-羟化酶是依赖细胞色素P_(450)的单加氧酶

对诱导的红豆杉细胞进行差异显示,获得了一个细胞色素P_(450)基因家族,其中一个在酵母中表达,被认为是紫杉烷10β-羟化酶(taxane 10β-hydroxylase)。对在酵母中不能表达的克隆,采用秋粘虫-杆状病毒体系进行异源表达,试图获得这些克隆的基因功能。 方法和材料:用带有细胞色素P_(450)