气相色谱-质谱联用选择离子监测方法定量分析低浓度胞内游离氨基酸的^(13)C同位素丰度

胞内游离氨基酸具有周转快的特点,其13C同位素丰度能快速反映胞内代谢状态的变化。但胞内游离氨基酸的浓度很低,现有的基于气相色谱-质谱联用全扫描模式的13C同位素丰度检测方法不能满足要求。本研究考察理论上检测精度更高的选择离子监测方法在胞内游离氨基酸13C同位素丰度分析中应用的可能性。首先在全扫描模式下分析了不同氨基酸的断裂规律,找出与每种氨基酸对应的特征碎片,建立起包含有16种胞内游离氨基酸的特征碎片库。利用此特征碎片库,在样品分析时只需检测特定m/z处的信号,从而实现选择离子监测,提高信号质量。对标准品的检测结果表明,与全扫描模式相比,本方法的信噪比、测量精度和准确性分别提高了17倍、2倍和3.8倍。在对辅酶Q10生产菌株样品的分析中,本方法成功检测出8种胞内游离氨基酸的同位素丰度。

酶催化法测定^(13)C标记尿素同位素丰度

建立酶催化法测定^(13)C标记尿素同位素丰度的快速检测方法。在特殊制作的三球反应管中经过2步反应:(1)利用脲酶的专一性将尿素-^(13)C催化转化生成碳酸铵-^(13)C,在40℃下,反应5 min;(2)经过酸化生成^(13)C标记CO_(2),将气体引入MAT-271气体同位素质谱仪中,检测质荷比为44和45离子流强度,并计算^(13)C同位素丰度。结果表明,测定值与标样的^(13)C标示值误差在0.1%以内,精密度RSD<0.1%,建立的检测方法与现行行业标准方法测试结果基本一致,该方法操作相对简便快速、专一性强,适用于呼气试验诊断试剂及原料药尿素-^(13)C中同位素丰度的快速检测。

超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用检测红色糖多孢菌胞内中间代谢物同位素丰度

采用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪(LC-MS/MS),建立了能精确检测红色糖多孢菌胞内代谢物^(13)C同位素丰度的方法。在优化的超高效液相色谱的条件及三重四极杆串联质谱的离子传输电压和碰撞池电压下,筛选出各胞内代谢物的最佳离子对。根据物质在LC-MS/MS中生成的母离子和子离子碳链长短及子离子是否含有^(13)C等特性,建立了"一对一"法、"一对多"法和单级质谱SIM法等同位素丰度检测方法。利用这些方法,检测了自然标记标准品和^(13)C标记实验样品,根据实验值与理论值的接近程度筛选出最优方法。结果表明,对于以磷酸糖类为代表的子离子不含有^(13)C的代谢物,"一对一"法最有效;对于以有机酸类为代表的母离子和子离子都含有^(13)C的短碳链代谢物,"一对多"法更有优势;对于以辅酶A类为代表的母离子和子离子都含有^(13)C且碳链较长的代谢物,单级质谱SIM法才能发挥作用。建立的同位素丰度检测方法具有较好的准确度,可应用于红色糖多孢菌胞内代谢物同位素丰度的检测,为后续研究菌体的代谢机理,实现红霉素的高效表达奠定了基础。

土壤呼吸及其^(13)C同位素测定方法的对比研究

为比较不同方法在土壤呼吸及其^(13)C同位素测定中的差异,应用气相色谱仪法(GC-TCD)、稳定同位素比值质谱仪气体进样法(Gasbench-IRMS)、甲酚红显色法(MicroResp)、碱液吸收法4种方法测定土壤呼吸速率,并采用Gasbench-IRMS法和碱液吸收法两种方式检测土壤呼吸的^(13)C同位素丰度,以期准确评估土壤呼吸及碳排放,并为相关研究提供参考。结果表明:(1)两种仪器法(GC、IRMS)测定土壤呼吸速率的数值结果相近(基础呼吸)或趋势一致(诱导呼吸),且重复性好(标准偏差分别为0.011、0.010mg/(kg·h)),准确度高;MicroResp法的测定结果与仪器测量值较为相近,但分辨率较低;碱液吸收法的测定结果较真实值偏高(当土壤有机质含量低时)或偏低(当土壤有机质含量高时)。(2)在测定CO_(2)中的^(13)C含量上,Gasbench-IRMS法直接测定的结果误差小(δ^(13)C值的标准偏差为0.137‰),接近实际值,可以准确地反映出土壤微生物呼吸对底物的利用状况。综上,仪器法较化学分析法(MicroResp、碱液吸收)更能准确测定土壤呼吸及其^(13)C同位素。

亚硝化细菌在厌氧氨氧化过程中固碳路径研究

为研究厌氧氨氧化过程中亚硝化细菌(AOB)的固碳能力,在不同进水基质的条件下对亚硝化细菌进行模拟研究并确立优化运行条件,用13C同位素示踪法和实时荧光定量PCR确定亚硝化细菌的固碳路径。结果表明,NH4+^-N、HCO3^-、Ca^2+、Mg^2+的质量浓度分别为15、250、113、100 mg/L,微生物促进剂的体积分数1 ml/L时系统脱氮效果较好,亚硝酸盐积累率高达96.95%。13C同位素示踪发现污泥中的13C丰度明显增加,进水中投加的无机碳参与了微生物体内的碳代谢。实验确定了短程硝化细菌中存在遵循卡尔文循环固碳途径的功能基因,且该基因丰度对氮素的响应度比对其他基质大。

无机碳在厌氧氨氧化系统中的迁移转化

基于厌氧氨氧化(Anammox)反应,采用13C同位素示踪法分析无机碳(IC)在工艺中的迁移转化路径,考查厌氧氨氧化工艺的固碳潜力及厌氧氨氧化菌相关的固碳机理;同时,结合微生物分子学等方法,通过比较反应前后NH4+-N、NO2--N、TN及IC的变化,分析推导出工艺的固碳机理。结果表明,在进水IC为10.70 mg左右时,系统平均固碳率在12.05%以上;经13C标记处理后的Anammox污泥中13C丰度值由1.07%增加至1.17%以上;Anammox污泥中cbbLR1基因拷贝数经氮素和IC影响后分别为5.79×108copies·g-1和5.56×108copies·g-1,较处理前均有所增加,但变化不明显。进水中投加的IC参与了微生物体内的碳代谢;厌氧氨氧化菌存在遵循卡尔文循环固碳途径的功能基因。cbbLR1基因丰度与氮素浓度之间呈显著相关,与IC浓度之间的相关性不明显,说明该基因丰度对氮素的响应度比IC大。