重组大鼠14-3-3γ蛋白在大肠杆菌中的融合表达与分离纯化

目的:利用分子克隆技术在原核细胞中研究14-3-3γ融合蛋白的表达及分离纯化。方法:采用RT-PCR法从大鼠心肌组织中扩增14-3-3γcDNA编码区,并将其重组于谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达质粒pGEX-KG中,免疫印迹法检测表达产物。结果:经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达,表达产物的蛋白量约为菌体总蛋白的27.08%,相对分子质量为56000左右。能与抗鼠14-3-3γ多克隆抗体特异性结合。结论:表明成功构建了GST-14-3-3γ融合蛋白载体,在大肠杆菌中有高效表达,并具有良好的免疫反应性。

14-3-3γ对烧伤及LPS诱导所致大鼠心肌损伤的保护作用

目的:研究14-3-3γ在烧伤及脂多糖(LPS)引起的心肌损伤中的保护作用。方法:体内实验建立大鼠烧伤及LPS损伤模型,检测3、6、12、24 h各时点心功能及心肌细胞14-3-3γ蛋白表达水平的改变;体外实验采用新生大鼠心肌细胞,构建pFLAG-14-3-3γ质粒,于LPS损伤前24 h转染至心肌细胞,实验结束后检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性,MTT法测定细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡,线粒体肿胀实验检测线粒体通透性转换孔(mPTP)开放。结果:烧伤及LPS损伤模型大鼠心电图ST段均有明显改变,心肌细胞14-3-3γ蛋白表达水平均显著升高。转染了pFLAG-14-3-3γ质粒的心肌细胞能明显对抗随后的LPS损伤,与未转染组比较,14-3-3γ能明显提高细胞存活率,降低LDH活性,减少细胞凋亡,抑制mPTP的开放。结论:14-3-3γ可能通过抑制mPTP的开放对烧伤及LPS所致的心肌损伤起保护作用。