小麦高分子量谷蛋白14亚基基因的PCR体系及原核表达研究

小麦高分子量谷蛋白14亚基(HMW-GS1Bx14)被认为可能对面团加工品质有很大贡献的亚基.为了验证其功能,本研究欲通过PCR方法扩增14亚基基因,并使其在大肠杆菌中大量表达,为下一步用掺粉实验验证其功能奠定基础.但是由于HMW-GS1Bx14基因由2388bp个碱基组成,GC含量较高,并且在基因中包含约1.6kb的重复区,所有这些都使常规PCR难以成功扩增出HMW-GS1Bx14基因.本研究采取以下三种措施①设计一对高Tm值的特异引物;②采用二段法PCR反应程序;③改良PCR反应的缓冲体系、添加有机溶剂(DMSO,甜菜碱等)和Taq酶保护剂(BSA等);最后成功地扩增出目的片段.此外由于不同生物间对密码子使用存在很大差异,因此HMW-GS1Bx14基因很难在大肠杆菌中得到有效大量的表达.本研究选用万能菌株Rosetta(DE3)plysS作为表达用菌,从而克服了不同生物间密码子使用偏爱性的问题,成功的使HMW-GS1Bx14得到表达,为下一步研究HMW-GS1Bx14的基因功能奠定了基础.

山东小麦品种中高分子量麦谷蛋白1Bx14亚基特异PCR标记

根据已知小麦1Bx14基因序列设计一对特异引物,对HMW -GS在Glu -Bx14位点已知的7个小麦品种进行了PCR扩增,结果表明,凡具有1Bx14的品种都能扩增出4 19bp的特异性带,与SDS -PAGE电泳结果一致。利用这一特异性标记对山东推广的2 0个小麦品种进行检测,发现7个品种带有1Bx14基因。研究表明,与SDS -PAGE相比,PCR标记更加快速、简便和准确。

小麦14+15谷蛋白亚基基因的RAPD分析

利用分离群体分组分析法 BAS 对山农9021中的14+15亚基基因进行RAPD分析,从85个引物中筛选出引物OPF07,可在含有14+15亚基基因的单株中稳定地扩增出特异DNA带,将其命名为OPF071275,它与14+15优质亚基基因的遗传距离为8.58±0.821cM,该标记经多次重复表现稳定,可以作为14+15亚基基因的一个分子标记.

小麦2、14+15、5+10亚基组合的创制及生化标记选择

为了创制出更理想的优质亚基组合类型材料,将分别含有14+15、5+10和2*亚基的小麦材料进行杂交,利用SDS-PAGE技术,对杂交亲本及其后代(F3)进行HMW-GS组成分析。结果表明,杂种后代中HMW-GS组成变异较大,筛选到比较理想的亚基组合类型2*、14+15、5+10和2*、17+18、5+10的材料各2份,筛选到1、14+15、5+10的材料1份,筛选到1、17+18、5+10的材料6份,为高产、优质新品种选育提供了依据。

蛋白磷酸酶1调节亚基14B对神经母细胞瘤细胞有丝分裂进程的调控作用

目的 研究蛋白磷酸酶1调节亚基14B(PPP1R14B)对神经母细胞瘤(NB)细胞有丝分裂进程的调控作用,为其治疗提供潜在新靶标。方法 在NB细胞SK-N-BE(2)-M17中转染2条不同序列小干扰RNA(siRNA)(PPP1R14B siRNA#1和#2)敲低PPP1R14B,实时定量PCR和Western印迹法检测PPP1R14B的敲低效果。在SK-N-BE(2)-M17 GFP-H2B细胞中转染PPP1R14B siRNA#1和#2,Time-lapse活细胞成像技术动态监测敲低PPP1R14B对该细胞有丝分裂进程的影响。采用酶切克隆法构建靶向PPP1R14B的2条不同序列短发夹RNA(shRNA)(sh PPP1R14B#1或#2)慢病毒质粒,并感染SK-N-BE(2)-M17细胞建立PPP1R14B稳定敲低细胞,Western印迹法检测其敲低效果,克隆形成实验观察敲低PPP1R14B对SK-N-BE(2)-M17细胞生长的影响。基于GEO数据库的临床数据,按NB不同临床分期分组,分析各组样本中PPP1R14B mRNA表达水平及其与预后的相关性。结果 与转染对照siRNA相比,转染PPP1R14B siRNA#1和#2均可有效敲低SK-N-BE(2)-M17细胞中PPP1R14B mRNA和蛋白表达(P<0.01)。Timelapse活细胞成像结果显示,与转染对照siRNA相比,转染PPP1R14B siRNA#1和#2组SK-N-BE(2)-M17GFP-H2B细胞有丝分裂期时间延长(P<0.05),且主要是有丝分裂前中期时间显著延长(P<0.01)。Western印迹法结果显示,与转染对照shRNA相比,转染sh PPP1R14B#1和#2均可有效敲低SK-N-BE(2)-M17细胞中PPP1R14B蛋白表达(P<0.01);克隆形成实验结果表明,转染sh PPP1R14B#1或#2稳定敲低组细胞克隆形成数亦明显降低(P<0.01)。GEO数据库分析显示,PPP1R14B mRNA表达水平与NB恶性程度呈正相关,与患者预后呈负相关。结论 敲低PPP1R14B导致SK-N-BE(2)-M17细胞有丝分裂期阻滞和生长减慢,PPP1R14B在NB发生发展中发挥重要作用。

MFG-E8和GNA14在子宫内膜异位症相关性卵巢癌中的表达及其临床意义

目的探讨乳脂球表皮生长因子8(MFG-E8)和G蛋白亚基α-14(GNA14)在子宫内膜异位症相关性卵巢癌(EAOC)中的表达及其临床意义。方法选取2015年5月—2017年5月华北医疗健康集团峰峰总医院EAOC患者51例(EAOC组)、非典型子宫内膜异位症(AEM)患者63例(AEM组)、卵巢型子宫内膜异位症(EMT)患者82例(EMT组)。收集所有患者的临床资料,并检测病变组织中MFG-E8、GNA14表达。对EAOC患者随访5年。采用Kaplan-Meier生存曲线分析EAOC患者的生存情况。采用多因素Cox回归分析评估EAOC患者死亡的危险因素。结果EAOC组MFG-E8阳性率为82.35%、GNA14阳性率为70.59%,均显著高于AEM组(41.27%、44.44%)和EMT组(25.61%、23.17%)(P<0.001)。MFG-E8高表达组和低表达组肿瘤直径、肿瘤级别、国际妇产科联合会(FIGO)分期、淋巴转移情况差异均有统计学意义(P<0.05)。GNA14高表达组和低表达组淋巴转移情况差异有统计学意义(P=0.009)。Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示,MFG-E8高表达组和GNA14高表达组无进展生存期分别短于MFG-E8低表达组和GNA14低表达组(P<0.05)。多因素Cox回归分析结果显示,FIGO分期Ⅱ期、淋巴转移、MFG-E8高表达、GNA14高表达是EAOC患者死亡的独立危险因素[风险比(HR)值分别为2.337、2.519、3.133、3.080,95%可信区间(CI)分别为1.258~4.342、1.332~4.764、1.381~7.108、1.318~7.197,P<0.01]。结论MFG-E8、GNA14在EAOC患者癌组织中呈高表达,且与患者预后不良密切相关,或可作为EAOC患者的预后评估指标。

小麦中高分子量麦谷蛋白的高效分离回收

以普通小麦小偃6号为材料,研究从SDS-PAGE中快速回收和累积蛋白亚基的方法。采用制备电泳(17 cm×17 cm×1.5 mm)进行分离,KC l快速染色,将目的蛋白条带切下,置于透析袋中电洗脱回收蛋白亚基。结果表明,在蛋白提取过程中加入四乙烯吡啶与常规方法相比能够更好地分离高分子量麦谷蛋白14和15亚基,回收后的14亚基经电泳检测为单点纯。本方法为高效分离回收小麦中高分子量麦谷蛋白提供了新的技术思路。