胡萝卜14-3-3基因家族的鉴定与分析

以胡萝卜为试材,采用分子生物学和生物信息学方法对胡萝卜14-3-3基因家族各成员进行鉴定,研究分析其理化特性、基因结构、保守结构域、复制事件、系统进化及顺式作用元件,以期为进一步研究胡萝卜14-3-3蛋白的功能提供参考依据。结果表明:胡萝卜中共鉴定到11个14-3-3基因,不均匀分布在6条染色体上,含有3~7个外显子,其中1对基因发生片段复制事件;编码的蛋白序列长度为236~264 aa,分子量为26.64~30.14 kD,等电点为4.65~5.33,具有7个Motif,全部为酸性非分泌型蛋白,定位在细胞核。系统进化分析显示,胡萝卜14-3-3蛋白分为ε类(3个)与非ε(8个)类2个亚族。此外,顺式作用元件分析结果表明,胡萝卜14-3-3基因含有大量激素与逆境胁迫相关元件。

菊芋14-3-3基因家族的鉴定及其对非生物胁迫响应的分析

[目的]本文旨在鉴定菊芋14-3-3基因家族成员并分析它们对高温、低温、盐和干旱胁迫响应的表达模式,为研究14-3-3蛋白功能及菊芋育种提供依据。[方法]采用克隆和生物信息学研究基因性质,采用RNA-seq数据分析和RT-qPCR研究基因对非生物胁迫的响应模式。[结果]从菊芋中克隆到14-3-3基因家族的10个成员HtGRF1—HtGRF10,GenBank登录号为OP132618—OP132627。根据进化关系将其分为2个亚家族:HtGRF1—HtGRF7属于非ε组,HtGRF8—HtGRF10属于ε组,通常形成同源或异源二聚体。组织表达分析表明,HtGRF2/3/6/9在芽、根、茎、叶中的表达丰度较高,HtGRF3/5/9在块茎发育过程中前高后低。综合分析根和叶中HtGRF对非生物胁迫响应时发现,HtGRF6表达水平在高温、盐和干旱胁迫下下降;HtGRF2/3/7/8/9表达水平在盐胁迫下下降,而在干旱胁迫下上升;HtGRF1表达水平在低温胁迫下上升;HtGRF4/5表达水平在干旱胁迫下下降;而HtGRF10表达水平变化不显著。[结论]菊芋14-3-3蛋白是一个高度保守的多基因编码家族,在菊芋的生长发育和适应复杂环境中起着重要作用。

铁皮石斛14-3-3基因家族鉴定及表达分析

【目的】14-3-3蛋白,亦称通用调节因子(GRF),由多基因家族编码,在植物生长发育和逆境应答发挥关键的作用。鉴定铁皮石斛(Dendrobium officinale)GRF基因家族,为铁皮石斛GRF基因功能研究及遗传改良提供理论依据。【方法】通过生物信息学的方法鉴定铁皮石斛14-3-3家族成员,分析其理化性质、染色体定位、系统进化发育、基因结构和启动子顺式作用元件等,同时通过荧光定量PCR技术检测它们在不同组织、低温处理及盐胁迫处理后的表达量。【结果】铁皮石斛有17个GRF家族成员,分为ε类和非ε类亚族,不均匀地分布在7条染色体上,且存在7对串联复制基因。同一亚族成员基因结构、保守基序和蛋白质二级结构相类似。DoGRF家族基因的启动子区域存在大量激素和环境胁迫应答相关的调控元件。DoGRF家族基因在铁皮石斛各组织中均有表达,具有组织表达特异性,大多数基因在花器官中表达最高,其次是茎和根。同时,在低温处理、盐胁迫处理下呈现差异化表达,可能受到低温和盐胁迫的调控,特别是DoGRF2在铁皮石斛逆境应答过程中起着关键的作用。【结论】在全基因组水平从铁皮石斛中鉴定出17个DoGRF家族成员,不同基因对非生物胁迫响应不一,并具有器官表达特异性。DoGRF2对低温和盐胁迫呈现正向响应。

木薯14-3-3蛋白家族成员MeGRF3基因的原核表达及多克隆抗体制备

14-3-3蛋白是植物体内重要的信号转导调节分子,在碳代谢、逆境胁迫响应、生长发育等过程中发挥重要调控作用。为了深入解析14-3-3蛋白家族在木薯中的生物学功能,该研究采用酶切连接方法构建木薯14-3-3蛋白家族成员MeGRF3的原核表达载体,用热激法转化大肠杆菌Rosetta(DE3)株系,诱导表达带有MeGRF3的融合蛋白;使用纯化后的MeGRF3融合蛋白免疫新西兰公兔制备多克隆抗体,并检测抗体的效价和特异性。结果显示:(1)成功构建了木薯MeGRF3的原核表达载体pET-30a-MeGRF3,并诱导表达得到带有MeGRF3和6个His标签的融合蛋白。(2)MeGRF3融合蛋白主要以包涵体的形式存在,相对分子质量约为33 kD。(3)间接酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定的抗体效价为1024000。(4)Western blot分析显示,木薯叶片、茎尖、茎皮和块根中均检测到与MeGRF3蛋白大小一致的条带,说明MeGRF3在这4个组织器官中均表达,但主要是在茎尖和块根中大量积累,表明该研究成功制备的MeGRF3多克隆抗体的特异性较好。

烟粉虱MED隐种14-3-3基因克隆及时空表达谱分析

【目的】真核生物中,14-3-3蛋白是一类可与多种蛋白互作的调节蛋白,能够参与信号转导、免疫反应、生长发育和胁迫响应等。本研究旨在克隆烟粉虱Bemisia tabaci MED隐种的14-3-3基因的全长cDNA序列,了解该基因编码的蛋白特征和该基因的时空表达模式。【方法】使用RT-PCR技术克隆烟粉虱MED隐种的14-3-3基因全长cDNA序列,通过生物信息学软件和在线网站分析14-3-3基因的生物学特性;使用RT-qPCR测定14-3-3基因在烟粉虱MED隐种不同发育阶段(卵、1-4龄若虫和成虫)、雌雄成虫以及雌成虫头、胸和腹中的表达量。【结果】克隆并鉴定了烟粉虱MED隐种14-3-3基因的两个亚型:Bt14-3-3 epsilon(GenBank登录号:XM_019046102.1)和Bt14-3-3 zeta(GenBank登录号:XM_019057395.1),开放阅读框(ORFs)分别长771和744 bp,分别编码256和247个氨基酸,编码的蛋白是无跨膜螺旋区和信号肽的亲水性蛋白,其二级结构主要由α旋螺旋组成。系统发育树分析表明,Bt14-3-3 epsilon与褐飞虱Nilaparvata lugens、温带臭虫Cimex lectularius和茶翅蝽Halyomorpha halys的14-3-3 epsilon聚为一支,同源性较高;Bt14-3-3 zeta与褐飞虱的14-3-3 zeta的亲缘关系更近。RT-qPCR结果表明,Bt14-3-3 epsilon和Bt14-3-3 zeta在烟粉虱MED隐种的卵、雌成虫和雌成虫腹部中的表达量较高。【结论】明确了烟粉虱MED隐种14-3-3基因的两个亚型的全长序列、编码蛋白特征及时空表达特点,为后续研究14-3-3蛋白的分子功能奠定了基础。

苹果14-3-3基因家族的鉴定与MdGRF13的功能分析

【目的】通过鉴定和分析苹果14-3-3基因家族,并在苹果愈伤组织中过表达MdGRF13,研究逆境胁迫下其对苹果愈伤组织生长的影响,为探究该家族基因功能提供理论参考。【方法】利用生物信息学方法对苹果14-3-3基因家族进行鉴定和表达分析,构建MdGRF13过表达载体并转化苹果愈伤组织。【结果】共鉴定出36个苹果14-3-3基因家族成员。系统进化分析将该家族成员分为ε类和非ε类,每个亚族基因结构相似,且高度保守。共线性分析发现片段重复是该基因家族扩张的主要原因。基因组织特异性表达分析显示,苹果14-3-3家族基因在茎中多数上调表达。亚细胞定位表明MdGRF13蛋白定位在细胞核、细胞质和细胞膜上。qRT-PCR分析发现,在PEG和NaCl处理下分别有14和13个基因在不同时间点上调表达。过表达型(OE)愈伤组织在PEG和NaCl处理下长势优于野生型(WT)。【结论】鉴定出36个苹果14-3-3基因家族成员,且各亚族成员结构高度保守。过表达MdGRF13增强了苹果愈伤组织的抗旱性和耐盐性。

小桐子14-3-3基因家族的鉴定及低温胁迫应答

14-3-3蛋白家族在真核生物中广泛存在且高度保守,以同源/异源二聚体形式与2个靶蛋白或1个靶蛋白的两个磷酸化Ser/Thr模体结构域结合来发挥其调控作用。以拟南芥14-3-3蛋白为探针序列,对小桐子蛋白质数据库进行搜索,共鉴定到9个14-3-3基因,其中ε类4个、非ε类5个,并对其理化性质、系统进化、基因结构、顺式作用元件及低温胁迫表达等进行了分析。结果显示,小桐子14-3-3基因在进化上较为保守,存在该家族中典型的9段α-螺旋结构,ε类基因结构包含7个外显子,非ε类包含4~5个外显子。另外,在9个14-3-3基因上游调控区都鉴定到多个激素与逆境胁迫应答元件。qRT-PCR分析结果显示,包含有低温应答元件的Jc14-3-3b与Jc14-3-3h基因在小桐子的各组织器官中都有表达,但存在组织表达特异性,都在茎中表达量较高,其次是根,而在叶中表达量相对较低。同时,Jc14-3-3b与Jc14-3-3h基因都属于低温诱导表达基因,分别在茎与根中低温胁迫0.5~3.0h达到最大表达量,与小桐子的抗冷性形成直接相关。本研究为小桐子14-3-3基因家族的克隆与功能验证提供了参考。

鱼类14-3-3基因家族研究进展

14-3-3基因家族在鱼类的生长发育、信号传导和环境适应中扮演着重要角色,对其进行系统地研究,有助于理解其生物学功能及调控机制。从鱼类14-3-3基因家族的结构特征、生物学功能、环境响应及其进化等方面进行了综述。

杨树14-3-3基因家族的分子进化及表达模式研究

14-3-3蛋白在植物细胞信号传导中发挥重要的作用,探索木本植物14-3-3蛋白家族的进化模式对深入理解该基因家族的功能有重要的指导意义。本文采用生物信息学的方法,在基因组水平上搜索和鉴定了12个杨树14-3-3蛋白基因,其中ε类有7个,非ε类有5个。通过对杨树14-3-3基因家族的系统进化、序列相似性、基因结构和染色体位置分析,发现杨树14-3-3基因的扩张主要是通过最近的一次全基因组加倍事件产生的。在全基因组加倍事件中共产生5对重复基因对,Ka/Ks分析显示这5对重复基因对处于较强的净化选择压力。RT-PCR分析显示在杨树12个14-3-3基因中有8个在不同组织中均表达,另外4个基因的表达部位发生了变异。因此,杨树14-3-3基因家族的分子进化及表达模式的研究结果预示着基因重复后其功能发生了分化。

白刺14-3-3基因家族的鉴定及表达分析

为探明白刺(Nitraria tangutorum)14-3-3基因家族的基本特征及其进化关系,本研究基于白刺转录组数据,利用生物信息学方法,对白刺14-3-3基因家族成员进行鉴定,预测其理化性质、亚细胞定位、保守结构域,分析其系统进化关系及其基因在不同浓度盐、干旱处理下的组织器官表达模式。结果表明:从白刺转录组数据中初步筛选出10个14-3-3家族成员,其中具有完整蛋白质编码区(Coding Sequence,CDS)的9个成员,其蛋白的编码氨基酸的数目为212~297个,等电点在4.73~6.14之间,分子量范围是24.06~33.51 kDa,二级结构主要以α螺旋为主,三级结构高度保守;亚细胞定位预测显示该家族成员主要分布在细胞质上;表达模式分析表明,14-3-3基因在白刺不同组织器官中呈现不同的表达规律,且参与应答外界的干旱和盐胁迫。由此推测,14-3-3基因家族可能在白刺的胁迫防御方面发挥重要功能。本研究结果为进一步深入揭示白刺14-3-3基因家族的功能奠定基础。

茶树花蕾14-3-3蛋白基因的分子克隆及差异表达分析

【目的】从分子水平研究茶树花蕾发育阶段的相关基因表达,了解茶树花蕾的发育机理,利用分子生物学技术抑制茶树的生殖生长、促进营养生长。【方法】利用cDNA-AFLP技术对茶树花蕾发育早期和晚期的差异表达进行分析。采用RACE技术克隆到花蕾发育晚期阶段特异表达的、在花蕾发育中可能起重要作用的14-3-3基因,通过RT-PCR和Western-blot方法研究该基因转录水平和蛋白质表达水平的特点。【结果】在测定的大约1110个茶树花蕾cDNA片段中,122个(10.9%)是差异性表达的,其中87个在发育晚期特异表达,包括茶树14-3-3蛋白基因(GenBank登录号:DQ444463),其全长为1072bp,包含1个由783个核苷酸组成的ORF,编码260个氨基酸,5′非翻译区和3′非翻译区分别有67和222个核苷酸,该基因与其它植物的14-3-3蛋白基因在核苷酸序列和推导的氨基酸序列方面均有着比较高的相似性。RT-PCR和Western-blot分析表明该基因在茶树的晚期发育花蕾中特异表达。【结论】14-3-3蛋白仅存在于茶树发育晚期的花蕾中。cDNA-AFLP技术能用于茶树花蕾不同发育时期的基因分离研究。

基因甲基化导致鼻咽癌组织14-3-3σ表达下调

为探讨14-3-3σ基因甲基化在鼻咽癌发病中的作用,以75例鼻咽癌活检组织和25例正常鼻咽黏膜活检组织作为研究对象,采用甲基化特异性聚合酶链式反应(MSP)检测14-3-3σ基因甲基化状态,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测14-3-3σmRNA表达,免疫组织化学染色检测14-3-3σ蛋白质表达.结果发现,鼻咽癌组织14-3-3σ基因完全甲基化、不完全甲基化和未甲基化的例数分别为4例、59例和12例,正常鼻咽黏膜组织不完全甲基化和未甲基化的例数分别为7例和18例,鼻咽癌14-3-3σ基因甲基化频率显著高于正常鼻咽黏膜组织(84%vs28%,χ2=28,P<0.05).RT-PCR和免疫组织化学染色结果显示:14-3-3σ基因完全甲基化的组织样本无14-3-3σ表达,不完全甲基化的组织样本14-3-3σ表达显著降低,14-3-3σ基因甲基化与鼻咽癌淋巴结转移及鼻咽癌临床分期正相关.研究结果表明,鼻咽癌组织14-3-3σ基因存在高频甲基化,14-3-3σ基因甲基化导致14-3-3σ表达降低或缺失,14-3-3σ表达水平与鼻咽癌淋巴结转移及其临床分期相关.

水稻14-3-3蛋白家族的生物信息学分析

通过隐马尔柯夫模型(HiddenMarkovModel,HMM),对粳稻(OryzasativaL.ssp.japonica)基因组的蛋白质数据库进行搜索,结果获得8个1433蛋白的同源序列,其中发现4个新基因。通过对所有粳稻的1433蛋白的DNA序列与各种表达序列标签(ExpressionSequenceTags,ESTs)进一步比对,为1433蛋白找到了ESTs的证据。结果说明这些基因在水稻不同的处理和不同的部位都有所表达,而且不同成员之间的表达模式存在较大的差异。蛋白质多序列联配分析结果表明,存在可能的功能多态位点。通过基因结构和染色体定位的分析,确认了水稻基因组中存在ε样和非ε样两类1433蛋白。此外,对目前植物中的1433家族作了初步的进化分析。

拟穴青蟹14-3-3基因全长cDNA的克隆及组织表达分析

采用RT-PCR及RACE技术,从拟穴青蟹眼柄组织中克隆获得14-3-3基因cDNA全序列。序列分析结果表明:拟穴青蟹14-3-3基因全长1 112 bp,开放阅读框长744 bp,编码由247个氨基酸组成的蛋白,分子量为28.086 ku,等电点为4.675。与其他物种14-3-3基因氨基酸序列进行同源性比较分析显示,拟穴青蟹14-3-3基因与斑节对虾14-3-3基因同源性最高(95%),依次为墨吉对虾(93%)、苜蓿切叶蜂(92%)。聚类分析表明,拟穴青蟹14-3-3基因氨基酸序列与斑节对虾、墨吉对虾紧密聚为一支。经荧光定量检测,拟穴青蟹14-3-3基因在肝胰腺和肌肉中的表达量较高,其次为鳃、眼柄、心脏和肠,在胃中表达最少。盐度骤变实验结果表明:盐度胁迫24 h后,盐度的下降(5)或者上升(15、20、25、30)都引起了14-3-3基因在鳃中的表达量极显著上升(P<0.01),盐度变化的幅度越大,14-3-3基因的表达量越多。实验结果为进一步深入研究14-3-3基因的功能及调控机理奠定基础。

5杂-氮-2′-脱氧胞苷对顺铂耐药胃癌SGC-7901细胞14-3-3σ基因甲基化的影响

目的观察5-杂氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对顺铂耐药胃癌SGC-7901细胞14-3-3σ基因甲基化的影响;探讨14-3-3σ基因甲基化与顺铂耐药胃癌SGC-7901细胞耐药的关系。方法建立人胃癌顺铂耐药细胞株SGC-7901/CDDP,并用特异性甲基化抑制物5-Aza-CdR干预。MSP法检测14-3-3σ基因甲基化状态,蛋白质印迹法检测14-3-3σ蛋白表达,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞术分析细胞周期与凋亡。结果 SGC-7901/CDDP细胞的14-3-3σ基因高度甲基化并沉默,经过5、10μmol.L-15-Aza-CdR处理后,14-3-3σ蛋白重新表达,细胞发生顺铂耐药逆转,细胞活性抑制、在G0/G1期出现阻滞以及凋亡率明显增加。结论 5-Aza-CdR具有抑制顺铂耐药胃癌SGC-7901细胞14-3-3σ基因甲基化的作用,同时,顺铂作用与耐药机制部分依赖于14-3-3σ基因。

国人Creutzfeldt-Jakob病临床、病理、免疫组化、PrP基因、14-3-3蛋白及动物传递的研究

目的探讨国人Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ－Ｊａｋｏｂ病（ＣＪＤ）的临床、病理及免疫组化、ＰｒＰ基因、１４－３－３蛋白及实验鼠传递结果。方法 统计２４例ＣＪＤ患者的临床资料，进行脑组织病理检查。其中１０例脑切片作ＰｒＰ免疫组化染色，１０例进行ＰｒＰ基因表达，５例脑脊液行１４－３－３蛋白检测，７例进行实验鼠传递。结果（１）２４例ＣＪＤ中散发１９例，可能为医源性３例，家族性１例，与Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病并存１例；（２）国人ＣＪＤ急性、亚急性发病高达９６％，急性发病者病程短，脑萎缩不明显；（３）脑组织石蜡切片以ＰｒＰ抗血清为第一抗体免疫组化染色，均呈突触型阳性；（４）１４－３－３蛋白表达对ＣＪＤ的临床诊断有特异性；（５）活检脑组织对实验鼠传递成功。结论 国人ＣＪＤ发病过程和临床表现有若干特殊性，通过１４－３－３蛋白表达，可早期确诊ＣＪＤ，其对早期发现ＣＪＤ、减少医源性传播有重要意义。

弓形虫信号转导蛋白14-3-3基因的克隆与表达

目的 体外扩增弓形虫RH株信号转导蛋白 14 3 3 (Toxo 14 3 3 )基因编码序列 ,构建原核表达质粒 ,并表达Toxo 14 3 3。 方法 收集、纯化弓形虫RH株速殖子 ,提取RNA ,在设计合成的引物中引入EcoRI和XhoI酶切位点。应用RT PCR扩增Toxo 14 3 3基因片段 ,插入原核表达质粒 pET2 8a中 ,重组子双酶切、PCR和测序鉴定 ,转化大肠杆菌BL2 1并以异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达。 结果 从弓形虫RH株RNA中扩增出 80 3bp的Toxo14 3 3基因片段 ,构建重组质粒 pET2 8a/14 3 3 ;IPTG诱导 ,SDS PAGE显示表达产物的大小约 3 0 .7kDa ,Western印迹鉴定为Toxo 14 3 3。 结论 成功地从弓形虫RH株基因组DNA中获取了 14 3 3基因 ,构建了 pET2 8a/Toxo 14 3 3重组质粒 ,并获得高效表达。

人14-3-3 γ基因的腺病毒载体的构建及其在PC12细胞中的表达

目的:构建携带人14-3-3γ基因的重组腺病毒表达载体并确定其对PC12细胞的感染效率。方法:采用PCR方法,从Top10/pHis-14-3-3γ质粒中扩增14-3-3γDNA序列,将14-3-3γ基因定向克隆到穿梭质粒载体pAdTrack-CMV,经与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1载体同源重组后得到携带人14-3-3γ基因的重组腺病毒(pAd/14-3-3γ),采用PCR的方法对重组腺病毒进行鉴定,转染HEK293细胞进行包装和扩增,氯化铯密度梯度离心法纯化,半数组织培养感染剂量(50%tissue culture infective dose,TCID50)方法测定重组腺病毒的滴度。体外感染PC12细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)和Western Blot检测14-3-3γ蛋白的表达。结果:克隆得到人14-3-3γ基因,经PCR鉴定和测序证实结果正确,成功构建得到高滴度的重组腺病毒,并能高效感染PC12细胞。结论:本实验成功构建了表达14-3-3γ的复制缺陷型重组腺病毒Ad-14-3-3,为用14-3-3γ基因治疗帕金森病奠定了基础。

菠菜14-3-3蛋白基因的克隆及硝酸盐胁迫下的表达分析

利用RT-PCR和RACE技术,从菠菜中首次获得了14-3-3蛋白基因的全长cDNA序列(GenBank登录号JX952165),命名为So14-3-3。该基因全长1 166bp,开放阅读框801bp,编码266个氨基酸。序列比对发现So14-3-3蛋白与其他植物14-3-3蛋白氨基酸序列一致性高达77.6%～84.7%。半定量RT-PCR表明,随NO3-胁迫处理时间的延长和浓度的增加,菠菜根和叶中So14-3-3基因的表达增强。实验构建了pGEX4T-So14-3-3原核表达载体,并通过IPTG诱导后获得分子量约为56kD的蛋白。进一步的蛋白质印迹检测结果表明,随着NO3-处理时间的延长和浓度的增加,So14-3-3蛋白表达也增加。该实验结果为进一步研究So14-3-3蛋白功能提供了基本的实验基础。

梭梭14-3-3蛋白基因HaFT-1和HaFT-2克隆及表达分析

根据前期梭梭干旱转录组测序得到的Unigene序列,成功克隆2个梭梭14-3-3蛋白基因,分别命名为HaFT-1和HaFT-2,并对其进行基因表达分析。结果表明:HaFT-1基因在梭梭的根、种子中均可表达,且根中表达最强;HaFT-2基因在梭梭同化枝中表达最强,根的表达量次之。干旱胁迫后HaFT-1和HaFT-2基因的表达量均下调。本研究初步分析HaFT-1、HaFT-2基因的表达模式,为进一步研究该基因功能奠定基础。