重组人14-3-3zeta亚型单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的制备重组人14-3-3zeta亚型单克隆抗体(McAb),并检测14-3-3蛋白在人体组织器官的分布。方法将筛选出分泌抗人14-3-3zeta的杂交瘤细胞注射入BALB/c小鼠腹腔,制备腹水McAb,用辛酸-饱和硫酸铵沉淀法纯化,并鉴定其效价、纯度、浓度、特异性以及与天然抗原的亲和力,再用此单抗检测14-3-3蛋白在人体组织器官的分布。结果腹水及纯化后的单克隆抗体的效价分别为1∶107和1∶106。纯化后的纯度达97%,浓度为5mg/ml,能识别天然的人14-3-3蛋白,并能有效地识别兔和鼠脑组织的14-3-3蛋白。在人脑、肾、肺、肝、胃、卵巢、乳腺、结肠、胰腺等组织器官中,均检出14-3-3蛋白。结论已成功制备出重组人14-3-3zeta亚型单克隆抗体,并应用于实际检测,为研究14-3-3蛋白在机体生理和病理情况下的作用机制奠定了基础。

14-3-3蛋白在卵巢子宫内膜异位囊肿中的表达及意义

目的:研究14-3-3蛋白各亚型mRNA及蛋白在卵巢子宫内膜异位囊肿(ECO)的表达,探讨14-3-3蛋白与ECO发生发展的关系。方法:取ECO患者的异位子宫内膜组织(实验组)和正常子宫内膜组织(对照组)标本各30例。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测两组中14-3-3蛋白各亚型mRNA的表达;对两组表达差异的亚型,采用Western blot法检测其蛋白表达。结果:14-3-3蛋白7种亚型在ECO异位子宫内膜组织和正常子宫内膜组织均有表达。ECO异位子宫内膜组织中14-3-3σ亚型mRNA及蛋白表达显著下调(P<0.05),14-3-3ε、ζ亚型mRNA及蛋白表达显著上调(P<0.01)。结论:ECO异位内膜组织中14-3-3σ表达显著下调,14-3-3ε和14-3-3ζ表达显著上调,提示这3种蛋白亚型均可能与ECO的发生发展有关。

炎症应答中去泛素化酶圆柱瘤蛋白相互作用分子筛选和验证

目的筛选炎症应答中与去泛素化酶圆柱瘤蛋白(CYLD)相互作用分子,探究并验证CYLD和参与NF-κB信号通路调节的桥梁蛋白14-3-3家族分子之间是否在细胞内存在相互作用。方法通过免疫共沉淀(Co-IP)飞行质谱筛选可能与CYLD相互作用分子,在不同的刺激条件下诱导骨髓原代巨噬细胞向M1和M2极化,利用qRT-PCR、Western blotting技术检测CYLD及可能相互作用的候选分子14-3-3在巨噬细胞内的表达水平。结果CYLD抗体可以捕获14-3-3蛋白全部的7种亚型(β、γ、ε、η、ζ、δ、θ),提示CYLD很可能与14-3-3蛋白存在相互作用,选取质谱结果中得到特异性肽段最多的3种14-3-3亚型γ、ε、η(14-3-3γ/ε/η),检测结果显示在M0、M1、M2型巨噬细胞中CYLD和14-3-3γ/ε/η均有表达。构建了Myc-CYLD和Flag-14-3-3γ/ε/η真核过表达载体,用Flag抗体成功沉淀出CYLD蛋白,Co-IP结果提示CYLD和14-3-3γ/ε/η三种亚型均存在相互作用。免疫荧光实验显示CYLD和14-3-3在巨噬细胞内存在共定位现象。结论巨噬细胞炎症应答中CYLD和14-3-3γ/ε/η三种亚型可能存在物理上的相互作用。