土木香内酯对人骨肉瘤143B细胞恶性生物学行为的影响

目的:探讨土木香内酯(alantolactone,ALT)对人骨肉瘤143B细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响及其作用机制。方法:用不同浓度(0、4、6、8、10μmol/L)的ALT处理人骨肉瘤143B细胞后,用结晶紫染色法和MTT实验检测细胞的增殖能力,用划痕愈合实验、Transwell小室法、Hoechst33258染色法分别检测细胞的迁移、侵袭和凋亡水平,用qPCR及Western blotting(WB)分别检测细胞中E-cadherin和N-cadherin、caspase-3、cleaved-caspase-3(c-caspase-3)、PARP和cleaved-PARP(c-PARP)mRNA和蛋白表达水平。用荧光素酶报告基因实验检测T细胞淋巴因子或淋巴增强因子(T cell lymphocyte factor/lymphoid enhancer factor,TCF/LEF)转录活性,qPCR及WB检测β-catenin及MMP-7、c-Myc mRNA和蛋白表达水平。结果:ALT能够抑制骨肉瘤143B细胞的增殖、迁移和侵袭,同时促进细胞凋亡(P<0.05或P<0.01)。经8、10μmol/L ALT处理后,143B细胞中PARP m RNA和蛋白水平显著上调,c-caspase-3和c-PARP蛋白水平表达增加(均P<0.05);E-cadherin mRNA和蛋白水平表达上调、N-cadherin mRNA和蛋白表达水平下调,同时TCF/LEF转录活性明显下降(P<0.05或P<0.01),β-catenin、MMP-7和c-Myc mRNA和蛋白表达水平显著下调(P<0.05或P<0.01)。结论:ALT通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性从而抑制人骨肉瘤143B细胞增殖、迁移和侵袭,并促进其凋亡。

miR-144-3p靶向调控跨膜蛋白16A基因抑制骨肉瘤143B细胞的增殖和侵袭实验

目的阐明骨肉瘤143B细胞中miR-144-3p与跨膜蛋白16A(transmembrane protein 16,TMEM16A)的表达关系,明确miR-144-3p与143B细胞增殖和侵袭的关系。方法预测miR-144-3p和TMEM16A基因的互补配对关系,转染miR-144-3p模拟物后,Real-time PCR检测各组癌细胞中miR-144-3p和TMEM16A m RNA的相对表达水平,Western blot检测各组癌细胞中TMEM16A蛋白的相对表达,MTT法检测各组癌细胞的增殖,Transwell检测各组癌细胞体外的侵袭情况。结果 Target Scan和miRanda均显示miR-144-3p与TMEM16A基因互补配对较好。Real-time PCR和Western blot检测结果表明miR-144-3p的过表达能够降低TMEM16A m RNA和蛋白的相对表达水平。MTT法和Transwell实验发现miR-144-3p的过表达能够抑制143B细胞的增殖和侵袭。结论 miR-144-3p通过下调骨肉瘤143B细胞中TMEM16A的表达水平进而抑制癌细胞的增殖和侵袭。

miR-590-5p靶向调控STAT3基因对骨肉瘤143B细胞迁移和侵袭的影响

目的:探讨miR-590-5p和信号转导与转录激活因子3(STAT3)基因在骨肉瘤143B细胞中的表达,探讨miR-590-5p对STAT3基因的靶向作用及其对143B细胞迁移和侵袭的影响。方法:运用生物信息学方法对miR-590-5p和STAT3基因的靶向配对关系进行预测,采用荧光素酶报告系统鉴定;脂质体2000转染miR-590-5p模拟物以及干扰STAT3的siRNA后,real-time PCR检测miR-590-5p和STAT3 mRNA在癌细胞中的表达,Western blotting检测STAT3蛋白在癌细胞中的表达,细胞划痕实验检测癌细胞的迁移情况以及Transwell小室检测癌细胞体外的侵袭性。结果:生物信息学软件Target Scan和miRanda显示miR-590-5p和STAT3基因二者靶向配对良好,荧光素酶报告系统鉴定发现miR-590-5p能够抑制STAT3 mRNA表达。Realtime PCR和Western blotting检测结果均表明过表达miR-590-5p能够降低STAT3 mRNA和蛋白的表达。细胞划痕实验和Transwell实验发现过表达miR-590-5p能够分别抑制143B细胞的迁移和侵袭。结论:miR-590-5p通过负性靶向调控骨肉瘤143B细胞中STAT3基因的表达,进而抑制癌细胞的迁移和侵袭。

外源性FrzB拮抗Wnt信号转导并抑制人骨肉瘤细胞143B增殖

目的 Wnt信号异常激活与肿瘤发生有关,观察Wnt信号的天然拮抗剂FrzB对Wnt信号转导的影响和对肿瘤细胞增殖抑制。方法采用AdEasy系统构建重组腺病毒AdFrzB;卡那霉素抗性筛选、酶切鉴定及荧光显微镜和Western blot检测标记基因GFP和His表达等方法鉴定AdFrzB。AdFrzB与AdWnt3A共感染人骨肉瘤细胞株143B,AdGFP与AdWnt3A共感染为对照,β-catenin/Tcf荧光素酶反应系统检测FrzB对Wnt信号转导的影响;MTT实验检测FrzB对细胞增殖的抑制。结果卡那霉素抗性筛选及酶切鉴定获得pAdFrzB-His;检测到报告基因GFP和His表达,确证AdFrzB构建成功。FrzB抑制了Wnt信号转导并抑制了143B细胞增殖。结论 AdEasy系统有效构建了AdFrzB;外源性FrzB拮抗Wnt信号转导并抑制143B细胞增殖,FrzB可能是一种天然抗肿瘤因子。

黄连解毒汤对骨肉瘤143B细胞的抑制作用及机制

目的:探讨黄连解毒汤(HLJDD)对人骨肉瘤143B细胞的抑制作用及潜在机制。方法:SPF级大鼠随机平均分成4组,每组6只:HLJDD高、中、低剂量组分别给予HLJDD 6.30、3.15、1.58 g/kg灌胃,对照组给予等量水灌胃,均2次/d,连续灌胃1周,用于含药血清的制备。人骨肉瘤143B细胞分别应用低、中、高剂量HLJDD含药血清进行干预,通过CCK-8试剂盒检测不同剂量HLJDD对骨肉瘤143B细胞的增殖影响;通过划痕愈合实验观察不同剂量HLJDD对骨肉瘤143B细胞迁移的作用;通过流式细胞技术观察不同剂量HLJDD含药血清培养骨肉瘤143B细胞后的凋亡变化;通过Western Blot检测不同剂量HLJDD含药血清对骨肉瘤143B细胞的增殖相关蛋白(PCNA)、迁移相关蛋白(MMP-9、vimentin)及凋亡相关蛋白(cleaved caspase-3、caspase-3、Bax、Bcl-2)的影响,Western Blot进一步检测低、中、高剂量HLJDD含药血清对β-catenin及其相关信号分子c-Myc的影响。结果:与空白组和对照组比较,骨肉瘤143B细胞经不同剂量的HLJDD处理后,细胞的增殖率、迁移率均显著降低(P<0.05),中、高剂量组细胞凋亡率显著增加(P<0.05);HLJDD低、中、高剂量组均能够显著下调细胞增殖相关蛋白PCNA、迁移相关蛋白MMP-9(HLJDD低剂量组除外)、vimentin水平以及抗凋亡蛋白Bcl-2水平(P<0.05);此外,中、高剂量组HLJDD含药血清能够显著上调促凋亡蛋白Bax水平以及caspase凋亡通路中cleaved caspase-3水平(P<0.05),而caspase-3表达显著下调(P<0.05);β-catenin和c-Myc表达水平在HLJDD各剂量组均被显著下调(P<0.05)。结论:HLJDD促进了人骨肉瘤143B细胞的凋亡,抑制了人骨肉瘤143B细胞的增殖和迁移,从而起抗肿瘤作用,可能是通过抑制Wnt信号通路实现的。

人骨肉瘤细胞株143B转移和浸润中双氢青蒿素抑制作用的研究

目的:研究双氢青蒿素(Dihydroarteminin,DHA)对人骨肉瘤细胞株143B转移和浸润的影响并对其机制进行探讨。方法:通过划痕愈合试验、Transwell穿梭试验、人工基质胶浸润试验,检测DHA对143B细胞的转移迁徙能力的影响;Western Bloting检测与人骨肉瘤细胞株143B转移和浸润密切相关的两种蛋白:基质金属蛋白酶(Matrix Metal Proteinase 9,MMP-9)和血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF),经DHA作用后表达的影响。结果:划痕愈合试验、Transwell穿梭试验和基质胶侵袭试验结果均呈现阳性,表明DHA可有效地抑制人骨肉瘤细胞143B的转移与浸润;Western Bloting结果显示MMP-9和VEGF的表达受到明显抑制,抑制效果随着其浓度增大和时间延长而增加。结论:双氢青蒿素具有明显的抑制人骨肉瘤细胞143B的转移和浸润的作用,可能与双氢青蒿素能抑制MMP-9和VEGF表达有关。

岩藻多糖诱导人骨肉瘤细胞143B损伤作用及其机制

目的:探讨岩藻多糖(FUC)诱导人骨肉瘤细胞143B损伤作用及分子机制。方法:采用不同浓度FUC(0、0.5、1、10、100、400、800μg/ml)处理143B细胞48 h后,通过MTT法和化学比色法检测FUC对143B细胞活性和乳酸脱氢酶(LDH)释放的影响,每个浓度设6个复孔。根据MTT结果计算出IC 50为244.5μg/ml。后续实验分组为对照组(不加FUC)、FUC(10μg/ml)组、FUC(100μg/ml)组、FUC(400μg/ml)和阳性对照组(白藜芦醇,40μmol/L),每个浓度设4个复孔,每组实验至少重复3次。流式细胞术检测细胞凋亡情况和细胞内活性氧(ROS)含量的变化;吖啶橙(AO)染色和Lyso-Tracker Red染色观察细胞自噬溶酶体形成情况;化学比色法检测丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性;Western blot法检测细胞中核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素氧合酶1(HO-1)和自噬相关蛋白微管相关轻链蛋白3(LC-3)、Atg7、Beclin-1和p62等蛋白表达情况。结果:与对照组比较,FUC(100和400μg/ml)处理组143B细胞活性明显降低(P<0.01),上清液中LDH水平(P<0.05或P<0.01)、细胞凋亡率(P<0.01)、细胞内ROS水平和MDA含量显著增加(P<0.01)、Atg7和Beclin-1等蛋白表达明显上调(P<0.05或P<0.01),LC-3I向LC-3II转换显著及自噬溶酶体形成增加(P<0.01),而细胞中SOD活性、GSH-Px活性和Nrf2、HO-1及p62蛋白表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01)。结论:100和400μg/ml的FUC处理骨肉瘤细胞143B,可诱导其氧化损伤和自噬性死亡。

蛋白激酶C在人骨肉瘤细胞多药耐药中的作用及机制

目的研究蛋白激酶C(PKC)主要亚型在人骨肉瘤143B细胞中的表达情况及其与143B细胞耐药的关系。方法采用Western blot法检测PKC主要亚型α、β和γ磷酸化形式p-PKCα、p-PKCβ、p-PKCγ和多药耐药蛋白-1(mutidrugresistance protein-1,MDR-1)在人骨肉瘤143B/WT野生型细胞和143B/ADM耐药细胞中的表达水平,通过PKC特异性抑制剂staurosporine抑制PKC对MDR-1蛋白表达的影响;CCK法检测药物敏感性;荧光分光光度计法检测细胞内阿霉素浓度,流式细胞术检测细胞凋亡水平和细胞外排罗丹明水平。结果相对于143B/WT野生型细胞,143B/ADM耐药细胞中p-PKCα表达显著增加,而p-PKCβ和p-PKCγ表达则无明显差异,同时143B/ADM耐药细胞中MDR-1表达也明显上调;143B/ADM耐药细胞对阿霉素的耐药指数为15.7,而加入staurosporine抑制143B/ADM细胞PKC表达后,细胞耐药指数下降为5.5(P<0.01);143B/ADM耐药细胞接受ADM处理后,细胞凋亡率为(28.41±4.33)%,而其PKC表达被抑制后,细胞内阿霉素浓度增加的同时(P<0.01),细胞凋亡率增加为(70.63±4.80)%(P<0.01),外排罗丹明减少,同时MDR-1蛋白表达明显下调。结论人骨肉瘤耐药细胞中过表达的PKCα可通过调控MDR-1参与骨肉瘤耐药。

沉默MAT1基因通过SDF1-CXCR4信号通路抑制骨肉瘤细胞增殖与迁移

目的探讨沉默MAT1基因表达对骨肉瘤细胞增殖与迁移的影响,以及对SDF1-CXCR4信号通路的作用。方法qRT-PCR检测人成骨细胞hFOB1.19与骨肉瘤细胞株Saos-2、MG63、U2OS、143B中MAT1 mRNA的表达水平。将对数生长期143B细胞分为空白对照组(不进行转染)、阴性对照组(转染阴性对照siRNA-NC)和siRNA-MAT1组(转染siRNA-MAT1),通过CCK-8、流式细胞术及Transwell小室法分别检测各组143B细胞增殖活力、细胞周期和迁移能力,Western blot法检测各组143B细胞中SDF1和CXCR4蛋白表达情况。结果与hFOB1.19细胞比较,骨肉瘤细胞株Saos-2、MG63、U2OS中MAT1 mRNA的表达水平明显升高(P<0.01),143B细胞中MAT1 mRNA的表达水平显著升高(P=0.000);siRNA-MAT1组143B细胞中MAT1 mRNA的表达水平较空白对照组(Blank组)和siRNA-NC组明显下降(P<0.01);与Blank组和siRNA-NC组比较,siRNA-MAT1组143B细胞增殖力明显降低,G 1期比例升高而S期比例降低,细胞迁移能力受到抑制,SDF1和CXCR4蛋白表达水平也明显下降(P<0.01)。结论沉默FOSL2基因的表达可抑制骨肉瘤细胞143B的增殖和迁移能力,机制可能与下调SDF1和CXCR4表达有关。

丹参酮ⅡA对荷骨肉瘤裸鼠肿瘤生长及相关细胞因子水平的影响

目的探讨丹参酮ⅡA对荷骨肉瘤裸鼠肿瘤生长及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-2(interleukin-2, IL-2)、可溶性血管黏附分子-1(soluble vascular cell adhesion molecule-1, sVCAM-1)水平的影响。方法 40只裸鼠皮下接种人骨肉瘤143B细胞建立异种移植瘤模型后,随机分为低、中、高剂量干预组(分别腹腔注射丹参酮ⅡA 10、20、40 mg/kg)和模型组(腹腔注射生理盐水),每组10只,连续给予相应药物3周后,计算各组抑瘤率;采用ELISA法检测血清TNF-α、IL-2及sVCAM-1水平;采用Western blot法检测肿瘤组织β-catenin、Dkk-1蛋白相对表达量;采用实时荧光定量PCR法检测肿瘤组织β-catenin、Dkk-1 mRNA相对表达量。结果低、中、高剂量干预组抑瘤率(38.21%、46.19%、56.42%)依次增高(P<0.05);低、中、高剂量干预组血清TNF-α[(25.56±1.86)、(26.38±2.35)、(27.98±1.60)ng/L]、IL-2[(512.56±27.86)、(553.49±24.35)、(584.73±31.57)ng/L]高于模型组[(21.45±2.15)、(449.36±12.35)ng/L](P<0.05),sVCAM-1[(139.26±14.21)、(120.37±12.45)、(109.91±11.61)ng/L]低于模型组[(176.39±18.25)ng/L](P<0.05),肿瘤组织Dkk-1蛋白(0.47±0.05、0.59±0.02、0.78±0.04)及Dkk-1 mRNA相对表达量(0.43±0.05、0.57±0.06、0.81±0.05)高于模型组(0.36±0.03、0.34±0.03)(P<0.05),β-catenin蛋白(0.69±0.03、0.55±0.04、0.38±0.03)及β-catenin mRNA相对表达量(0.55±0.04、0.42±0.04、0.40±0.06)均低于模型组(0.81±0.05、0.68±0.05)(P<0.05);低、中、高剂量干预组血清IL-2水平及肿瘤组织Dkk-1蛋白和Dkk-1 mRNA相对表达量均依次升高(P<0.05),血清sVCAM-1水平及肿瘤组织β-catenin蛋白相对表达量均依次降低(P<0.05)。结论丹参酮ⅡA可通过抑制Wnt/β-catenin信号活性,上调TNF-α、IL-2水平,下调sVCAM-1水平,发挥抗体内骨肉瘤活性,其机制可能与激活抑制因子Dkk-1有关。