EGFR抑制剂AG1478联合奥沙利铂抑制PI3K/AKT通路促进H1975细胞自噬的作用机制

目的探究奥沙利铂(oxaliplatin,OXA)联合表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂AG1478对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)H1975细胞自噬的作用。方法采用梯度浓度的AG1478(0、5、10、15、20、25、30、35、40μmol·L^(-1))和OXA(0、25、50、75、88、100、112、125、150μmol·L^(-1))体外培养H1975细胞,MTT法检测AG1478和OXA对H1975细胞活力的影响,MDC法检测H1975细胞自噬水平,Western blot法检测PI3K/AKT信号通路(PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT)以及自噬相关蛋白(Beclin^(-1)、LC3Ⅱ)的表达水平;ROS探针H2DCFDA检测H1975细胞的ROS水平。结果MTT结果显示,OXA作用于H1975细胞的半数抑制浓度IC 50为70.86μmol·L^(-1);AG1478作用于H1975细胞的IC 50为24.24μmol·L^(-1);MDC实验结果显示,与对照组比较,(OXA-25、OXA-50、OXA^(-1)00)OXA单药组、AG1478单药组及联合用药组自噬水平明显升高;与OXA单药组(OXA-25)比较,联合用药组自噬水平升高;Western blot检测结果显示,与对照组比较,(OXA-25、OXA-50、OXA^(-1)00)OXA单药组、AG1478单药组及联合用药组PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达均下调,应用N-乙酰半胱胺酸(N-acetylcysteine,NAC)预处理后,联合用药组PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT下调水平被抑制;与OXA单药组(OXA-25)比较,联合用药组PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT的蛋白表达水平均下降;Western blot检测结果显示,与对照组比较,(OXA-25、OXA-50、OXA^(-1)00)OXA单药组、AG1478单药组及联合用药组Beclin^(-1)、LC3Ⅱ的蛋白表达上调,应用NAC预处理后,联合用药组Beclin^(-1)、LC3Ⅱ的蛋白表达被抑制,应用PI3K抑制剂(LY294002)预处理后,联合用药组Beclin^(-1)、LC3Ⅱ的蛋白表达明显上调;与OXA单药组(OXA-25)比较,联合用药组Beclin^(-1)、LC3Ⅱ的蛋白表达水平升高;H2DCFDA检测发现,与对照组比较,(OXA-25、OXA-50、OXA^(-1)00)OXA单药组、AG1478单药组及联合用药组ROS水平升高;与对照组比较,联合用药组ROS水平明显升高,NAC处理组ROS水平明显降低;与联合用药组相比较,NAC预处理的联合用药组ROS水平下降。结论AG1478联合OXA诱导NSCLC H1975细胞调控ROS水平升高,抑制PI3K信号通路的激活,进而促进H1975细胞自噬。

苏云金芽孢杆菌S1478-1分离株的特性鉴定及cry1Ac同源基因克隆

本研究对从海南岛尖峰岭热带雨林自然保护区的土壤样品中分离出的Bt菌株S1478-1进行了特性鉴定,研究表明S1478-1分离株菌落形态和生长特征和Bt参照菌株HD73极其相似。16SrDNA序列分析表明,S1478-1分离株与其它B.thuringiensis、B.cereus和B.anthracis的16SrDNA序列相似性达到99%。分离株能产菱形伴胞晶体,SDS-PAGE蛋白电泳分析表明,菌株在生长后期,形成芽孢同时分泌130kD大小的晶体蛋白。生物测定表明S1478-1分离株对小菜蛾具有很高的毒杀活性,LC50值高达5.159×108cfu/mL。初步显示S1478-1分离株可作为防治鳞翅目害虫的生物农药菌株。利用PCR-RFLP方法鉴定S1478-1分离株含有cry1Ac同源基因,以PCR粘性端克隆方法扩增全长基因,序列测定表明该基因ORF为3537bp,编码1178个氨基酸,推定的编码蛋白分子量为133.3kD,与其它cry1Ac基因序列最高达到99%同源,因此,该基因可作为杀虫工程菌及培育转基因抗虫作物的候选基因。

酪氨酸激酶抑制剂tyrphostin AG1478对乳腺癌细胞作用的机制探讨

目的:探讨表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor,EGFR)的小分子酪氨酸激酶抑制剂tyrphostin AG1478对乳腺癌细胞的作用机制。方法:以乳腺癌细胞MCF-7(EGFR-/+)和MDA-MB-468(EGFR+++)为研究对象,采用MTT及克隆形成实验检测AG1478对乳腺癌MCF-7和MDA-MB-468细胞增殖和生长效应的影响;Western印迹法测定EGFR、Akt和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的表达及活化水平;进一步应用FCM检测AG1478对MDA-MB-468细胞早期凋亡的影响。结果:AG1478可抑制MDA-MB-468细胞的增殖和生长(P<0.05),对MCF-7细胞增殖则无明显的抑制效应(P>0.05);同时,MDA-MB-468细胞经AG1478处理后,细胞中磷酸化Akt(p-Akt)和磷酸化MAPK(p-MAPK)的表达水平明显降低(P<0.05);FCM检测结果表明,AG1478可增加MDA-MB-468细胞的早期凋亡水平(P<0.05)。结论:AG1478可下调PI3K/Akt及Ras/Raf/MAPK信号通路,从而抑制乳腺癌MDA-MB-468细胞增殖及生长,并促进细胞凋亡;但其对MCF-7细胞无明显作用。

EGFR抑制剂AG1478对子宫内膜癌细胞上皮-间质转化的影响

目的:研究表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂AG1478对子宫内膜癌细胞增殖和上皮-间质转化的影响。方法:蛋白印迹法检测子宫内膜癌细胞上皮标记蛋白E-cadherin、α-catenin,间质标记蛋白N-cadherin、vimentin及MMP-9、MMP-2蛋白的表达水平。MTT法检测不同浓度AG1478对子宫内膜癌细胞的增殖抑制作用。蛋白印迹法检测AG1478对子宫内膜癌细胞E-cadherin、α-catenin,N-cadherin、vimentin及MMP-9、MMP-2蛋白表达水平的影响。体外迁移实验检测AG1478对子宫内膜癌细胞迁移能力的影响。结果:(1)EGFR过表达可下调子宫内膜癌细胞上皮标记蛋白并上调间质标记蛋白及MMP-9、MMP-2蛋白的表达水平(P<0.05)。(2)AG1478对两种子宫内膜癌细胞均有增殖抑制作用,以经转染稳定过表达EGFR的Ishikawa细胞更为敏感(P<0.05)。(3)AG1478上调子宫内膜癌细胞上皮标记蛋白并下调间质标记蛋白及MMP-9、MMP-2蛋白的表达水平,以转染EGFR的Ishikawa细胞变化更为显著(P<0.05)。(4)AG1478可减弱子宫内膜癌细胞的迁移能力,以过表达EGFR的Ishikawa细胞更为明显(P<0.05)。结论:EGFR抑制剂AG1478可有效地抑制子宫内膜癌细胞增殖和上皮-间质转化。

联合应用PI-103和AG1478抑制SH-SY5Y细胞增殖并促进其凋亡

目的观察联合应用PI-103和AG1478对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的作用。方法以m TOR拮抗剂PI-103、EGFR拮抗剂AG1478分别单独和联合处理SH-SY5Y细胞后,用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定不同浓度梯度的PI-103和AG1478对SH-SY5Y细胞增殖的影响并计算相应的半数抑制浓度(IC50),流式细胞术检测细胞凋亡,Hoechst-33528染色观察细胞凋亡的形态改变,Western blot检测PI3K/Akt信号通路相关蛋白的水平变化。结果 PI-103和AG1478均能抑制SH-SY5Y细胞增殖且半数抑制浓度(IC50)分别为3.2μmol/L,215.5μmol/L。IC50浓度作用24h后,Hoechst-33528染色和流式细胞术分析显示,联合用药的细胞凋亡率远高于单一用药。Western blot检测单独用药后磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)和磷酸化核糖体蛋白S6激酶(p-p70s6k)表达水平降低,且联合用药后p-Akt和p-p70s6k的水平降低更明显。结论 PI-103和AG1478联合用药能提高肿瘤细胞死亡率,其抗肿瘤效果有协同效应。

AG1478对大鼠脊髓损伤后反应性星形胶质细胞增生的影响

目的:研究表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂AG1478对大鼠脊髓损伤后反应性星形胶质细胞增生的影响。方法:SD大鼠60只,随机分为对照组,AG1478组和假手术组,各组20只。观察AG1478对大鼠脊髓损伤后磷酸化表皮生长因子受体(pEGFR)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达、髓鞘脱失、神经功能恢复及体重的影响。结果:AG1478组大鼠pEGFR和GFAP的表达较对照组明显减弱(P<0.01),损伤区脱髓鞘范围明显较对照组减小(P<0.01),BBB评分明显高于对照组(P<0.01),体重较对照组增加更明显(P<0.05)。结论:AG1478可能通过阻断星形胶质细胞上的EGFR通路抑制胶质增生,促进脊髓损伤大鼠神经功能的恢复。

表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂AG1478对卵巢癌细胞生物活性及纤溶酶原激活物抑制物1的作用机制研究

目的探讨AG1478对卵巢癌细胞生物活性及纤溶酶原激活物抑制物1(PAI-1)的作用机制。方法将CaOV-3细胞分为空白组和干预组,空白组为无药物干预的CaOV-3细胞,干预组分别为干预A组(5μmol的AG1478溶液)、干预B组(10μmol的AG1478溶液)、干预C组(15μmol的AG1478溶液)和干预D组(20μmol的AG1478溶液)。分别采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、流式细胞仪及Transwell小室检测细胞抑制率、凋亡率及侵袭数目,采用蛋白质印迹(Western blot)法和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测PAI-1、尿激酶型纤溶酶原激活剂受体(uPAR)蛋白和mRNA水平。结果不同时间点干预B组、干预C组和干预D组CaOV-3细胞抑制率均高于干预A组,干预D组CaOV-3细胞抑制率均高于干预B组,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。干预组CaOV-3细胞凋亡率均高于空白组,细胞侵袭数目均少于空白组,干预B组、干预C组、干预D组CaOV-3细胞凋亡率均高于干预A组,细胞侵袭数目均少于干预A组,干预D组CaOV-3细胞凋亡率高于干预B组,细胞侵袭数目少于干预B组,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。干预组CaOV-3细胞中PAI-1、uPAR蛋白和mRNA表达量均低于空白组,干预B组、干预C组及干预D组CaOV-3细胞中PAI-1、uPAR蛋白和mRNA表达量均低于干预A组,干预D组CaOV-3细胞中PAI-1、uPAR蛋白和mRNA表达量均低于干预B组,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。结论AG1478能够有效降低卵巢癌CaOV-3细胞存活率及侵袭性,加快凋亡,作用机制可能与阻碍PAI-1和uPAR信号通路表达有关。

表皮生长因子受体抑制剂AG1478对大鼠脊髓损伤后突触再生微环境的影响

目的:研究表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂AG1478对脊髓损伤后突触再生微环境的影响。方法:SD大鼠60只随机分为AG1478组、对照组和假手术组。AG1478组和对照组采用重物坠落打击法建立大鼠脊髓损伤模型,假手术组仅暴露硬脊膜,不损伤脊髓;AG1478组在脊髓损伤局部给予AG1478治疗,对照组和假手术均给予二甲基亚砜作对照治疗。于术后14及28 d,观察各组大鼠脊髓损伤后磷酸化表皮生长因子受体(pEGFR)、硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、生长相关蛋白43(GAP-43)的表达;于术后1 d及1、2、4、6、8周,观察各组大鼠神经功能恢复和体重变化的差异。结果:AG1478组pEGFR、CSPGs和GFAP的表达明显低于对照组(P<0.01),而GAP-43的表达明显高于对照组(P<0.01)。AG1478组BBB评分明显高于对照组(P<0.01),且体重较对照组增加更明显(P<0.05)。结论:大鼠脊髓损伤后局部应用AG1478治疗可明显改善损伤突触再生微环境,促进脊髓损伤神经功能的恢复。

AG 1478对GRC-1细胞的诱导凋亡作用及其机制

目的:探讨表皮生长因子受体阻滞剂TyrophostinAG1478对肾癌GRC-1细胞的诱导凋亡作用及其机制,为肾癌的生物学特征研究和药物治疗提供理论依据。方法:将不同浓度的AG1478作用于体外培养的肾癌GRC-1细胞,以研究表皮生长因子受体信号转导阻滞剂对细胞增殖和细胞周期分布的影响。结果:AG1478抑制肾癌GRC-1细胞的增殖,诱导细胞周期停留在G1期,诱导肾癌GRC-1细胞凋亡。结论:表皮生长因子受体特异性阻滞剂可抑制肾肿瘤细胞的增殖,有望成为抗肾脏恶性肿瘤药物。

Tyrophostin AG1478对粒细胞生成素反应细胞-1的诱导凋亡作用及其机制

目的探讨表皮生长因子受体阻断剂AG1478对肾癌粒细胞生成素反应细胞1(granulopoietinresponsivecell1,GRC1)的诱导凋亡作用及其作用机制,为肾癌的生物学特征研究和药物治疗提供理论依据。方法以不同浓度的AG1478作用于体外培养的肾癌GRC1细胞,噻唑蓝(MTT)法检测细胞生长抑制率,应用流式细胞仪观察细胞周期的改变,应用DNA电泳及电子显微镜观察细胞凋亡。结果AG1478抑制肾癌GRC1细胞的增殖,诱导细胞周期停留在G1期,诱导肾癌GRC1细胞凋亡。结论表皮生长因子受体特异性阻断剂可抑制肾肿瘤细胞的增殖,有望成为抗肾脏恶性肿瘤药物。

表皮生长因子受体抑制剂AG1478影响HuH7细胞黏附、迁移和侵袭的研究

目的:研究表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)抑制剂AG1478对人肝细胞癌细胞HuH7黏附、迁移及侵袭的影响及其相关细胞内信号转导通路,探讨EGFR在肿瘤转移中的作用。方法:用AG1478处理人肝细胞癌细胞HuH7;用MTT法检测细胞的黏附能力变化;用Transwell小室观察体外细胞迁移能力变化;Transwell小室结合Matrix胶检测肿瘤细胞侵袭能力的变化;用Western blot法检测Erk2及Paxillin蛋白表达。结果:AG1478(20μmol/L)处理后,细胞的黏附、迁移和侵袭能力分别下降了52%、49%和70%(P<0.01),Erk2及Paxillin的表达水平也明显降低(P<0.01)。结论:EGFR与人肝细胞癌细胞HuH7的黏附、迁移和侵袭性密切相关,并可能通过Erk2及Paxillin信号转导通路调控人肝细胞癌的发展。

AG1478抑制剂对白鲫体色发育的影响

鱼类的体色由基本色素细胞相互配合而成,色素细胞主要有4种类型:黑色素细胞、红色素细胞、黄色素细胞和虹彩细胞。AG1478是针对酪氨酸激酶(Tyr)的一种新型抑制剂。Tyr是黑色素生成过程中的关键酶,在黑色素细胞中呈特异性表达。本文主要阐述了白鲫四种色素细胞以及两种不同形态黑色素细胞的超微结构观察,探讨了AG1478抑制剂对白鲫早期体色发育的影响,实验结果表明抑制剂对白鲫早期体色发育没有明显影响。

EGFR抑制剂AG1478对宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响

目的:研究AG1478对宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响,为宫颈癌治疗提供初步理论基础。方法:通过CCK8、Western blot、RT-qPCR、免疫荧光及TUNEL染色,检测AG1478对HeLa细胞增殖的影响;凋亡相关基因及蛋白表达的改变;磷酸化ERK亚细胞定位的分布及早期凋亡现象。结果:AG1478对HeLa细胞的增殖有抑制作用;对EGFR、ERK及AKT的磷酸化活性有抑制作用同时激活凋亡信号通路;磷酸化ERK细胞核转位被阻断同时出现早期凋亡现象。结论:AG1478可以通过抑制EGFR及下游PI3K/AKT及Ras/MAPK信号通路抑制HeLa细胞增殖并引起凋亡。

EGFR抑制剂AG1478增强奥沙利铂诱导HCT116细胞凋亡的作用

目的探究酪氨酸激酶抑制剂AG1478(Tyrphostin AG1478,AG1478)联合奥沙利铂(oxaliplatin,OXA)对结直肠癌细胞HCT116凋亡的作用。方法MTT法检测AG1478联合OXA对HCT116细胞增殖的影响;实时荧光定量PCR法(qRT-PCR法)检测p53、caspase-3、Bcl-2、Bax的mRNA表达水平;Western blot法检测自噬和凋亡相关蛋白(p53、caspase-3、cleaved-caspase 3、Bcl-2、Bax、p62、LC3、IL-6)的表达水平。结果OXA和AG1478均抑制人结直肠癌细胞HCT116增殖(P<0.01),加药48 h后,IC_(50)分别为23.47和26.58 mg·L^(-1)。与OXA单药组比较,AG1478与OXA联合用药组明显抑制HCT116细胞的增殖能力(P<0.01);联合用药组LC3、IL-6蛋白表达明显高于对照组和单用药组,p62明显下调(P<0.01);联合用药组p53、caspase-3的mRNA和蛋白表达水平升高,cleaved-caspase 3蛋白表达水平升高,Bax/Bcl-2比值明显高于对照组(P<0.01)。结论AG1478与OXA联合用药,能协同增强对HCT116细胞的抑制作用,进而诱导凋亡。

奥沙利铂联合AG1478调控活性氧抑制PI3K/AKT通路对肺癌的影响

目的探究表皮生长因子酪氨酸激酶抑制药AG1478联合奥沙利铂(OXA)对非小细胞肺癌细胞H1299的影响。方法将体外培养的H1299细胞分为对照组(常规培养,不加药)、OXA-25组、OXA-50组、OXA-100组(分别用25、50和100μmol·L^(-1)OXA处理)、AG-20组(20μmol·L^(-1)AG1478处理)和OXA+AG组(25μmol·L^(-1)OXA+20μmol·L^(-1)AG1478处理)。用MTT法检测细胞存活率计算半数抑制浓度(IC50);用活性氧(ROS)探针H2DCFDA检测细胞ROS水平;用丹酰尸胺(MDC)法检测细胞自噬情况;用蛋白质印迹法检测磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、自噬蛋白(Beclin-1)、微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)的表达水平。结果OXA作用于H1299细胞的IC50为91.09μmol·L^(-1);AG1478作用于H1299细胞的IC50为31.83μmol·L^(-1)。对照组、OXA-25组、OXA-50组、OXA-100组、AG-20组和OXA+AG组的ROS水平分别为1.00±0.03、1.15±0.02、1.76±0.04、2.89±0.02、1.05±0.01和3.20±0.03;MDC水平分别为1.00±0.04、1.10±0.02、1.16±0.02、1.46±0.04、1.04±0.01和1.31±0.02;p-PI3K蛋白表达水平分别为1.12±0.05、0.88±0.06、0.72±0.07、0.60±0.05、0.91±0.07和0.64±0.09;p-AKT蛋白表达水平分别为1.09±0.04、0.87±0.08、0.77±0.07、0.63±0.05、0.76±0.05和0.46±0.03;Beclin-1蛋白表达水平分别为0.82±0.03、0.91±0.04、1.06±0.28、1.11±0.03、0.87±0.04和1.27±0.10;LC3-Ⅱ蛋白表达水平分别为0.65±0.08、0.82±0.11、1.08±0.12、1.38±0.09、0.72±0.11和1.38±0.15。OXA+AG组、OXA各剂量组的上述指标与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01);OXA+AG组的上述指标与OXA各剂量组比较,在统计学上差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论AG1478联合OXA作用于非小细胞肺癌细胞H1299,可升高ROS水平抑制PI3K/AKT信号通路激活,进而诱导细胞发生自噬。

表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂AG1478通过叉头转录因子O3a对非小细胞肺癌细胞中叉头转录因子M1表达的影响

目的 探讨表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂AG1478对非小细胞肺癌细胞中又头转录因子M1（FOXM1）、叉头转录因子O3a（FOX03a）的表达调控，以及RNA干扰技术下调FOXM1、FOX03a的表达后对肺癌细胞增殖及其对AG1478药物敏感性的影响。方法采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Westernblot法检测肺腺癌细胞株A549中FOXM1和FOX03amRNA和蛋白的表达情况；瞬时转染FOXM1和FOX03a小干扰RNA（siRNA）后，RT—PCR和Westernblot法检测转染效率和相关蛋白的表达；采用CCK-8法、集落形成实验和流式细胞仪分别检测细胞增殖、集落形成能力及细胞周期分布的改变。结果AG1478呈时间依赖性抑制FOXM1mRNA和蛋白的表达（均P〈0．05）。转染FOXM1siRNA后，FOXM1mRNA和蛋白及其细胞周期蛋白B1（eyelinB1）、c-Myc、Bcl-2蛋白的表达明显下降，p21和剪切后多腺苷二磷酸核糖聚合酶（cleaved—PARP）蛋白的表达则明显上调（均P〈0．05）。空白组、阴性对照组和FOXMIsiRNA转染组的集落数分别为（135．3±7．0）个、（125．3±7．5）个和（37．3±8．6）个，阴性对照组和FOXMlsiRNA转染组的集落形成抑制率分别为（7．40±0．94）％和（72．40±6．09）％（P〈0．05）。FOXMlsiRNA转染组的G2／M期细胞比例为（55．604-4．83）％，明显高于空白组[（24．30±1．95）％]和阴性对照组[（21．30±2．06）％，P〈0．05]。转染FOXM1siRNA后，可明显增加A549细胞对AG1478的药物敏感性（P〈0．05）。AG1478可诱导活化的FOX03a分子表达并促进其核定位；转染FOX03asiRNA后，FOXM1蛋白水平明显上调，并通过活化的AKT削弱AG1478对FOXM1表达的抑制。结论AG1478通过诱导活化的FOX03a表达及胞核重定位，下调FOXM1的表达，进而抑制肺癌细胞增殖，增加肺癌细胞对AG1478的敏感性。

GJB 1478-92 《飞机直流发电机控制器通用规范》的几个问题

对GJB 1478-92中的几项要求和概念作了说明和分析。

重离子辐射诱导玉米突变体I478的特性研究

通过田间试验,对玉米自交系掖478和经重离子辐射掖478干种子所获得的突变体I478的主要农艺性状和配合力进行了比较分析,结果表明:(1)I478植株形态发生明显改变,主要表现出株高、穗位高显著增加,气生根颜色发生改变;(2)I478的果穗性状总体变好,果穗长度、行粒数、穗粒数、穗粒重等性状极显著优于自交系掖478,但其果穗穗行数显著少于自交系掖478;(3)I478的主要生育时期如抽雄期、开花期、成熟期显著迟于自交系掖478;(4)自交系掖478配制组合的穗行数、穗粗、出籽率的平均值大于突变体I478配制组合的相应性状的平均值,突变体I478配制组合的单穗重、穗长、行粒数、百粒重、秃顶长度大于自交系掖478配制组合的相应性状的平均值。突变体I478一般配合力好,组合I478×N172单穗重量极显著高于临奥1号,单穗重量比临奥1号增加9.6%,可继续对该组合进行鉴定。

细胞分裂间期和分裂期ERK活性研究

【目的】研究分裂间期和分裂期细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)活性,以期了解细胞的生理活动。【方法】培养COS7、Hela-H2B和Cho-EGFR细胞,用有或无诺考达唑(Nocodazole)处理后获得分裂期和分裂间期细胞;再用表皮生长因子(EGF)或AG1478处理,分别收集分裂期和分裂间期细胞,裂解后制备蛋白样品,SDS-PAGE后进行免疫杂交,检查蛋白的表达情况。【结果】细胞经EGF刺激后,EGFR在分裂间期和分裂期出现明显磷酸化。MAPK通路下游蛋白ERK磷酸化水平在分裂间期显著高于分裂期(P<0.05)。EGF质量浓度可影响EGFR的活性,但对ERK磷酸化并未产生明显的影响;在相同条件下,1 ng/mL EGF处理的ERK磷酸化水平与其他质量浓度的EGF处理差异不显著(P>0.05)。0.5μmol/L AG1478可明显抑制EGFR活性,并导致Hela-H2B细胞的ERK磷酸化水平降低;而AG1478浓度为2.5μmol/L时,COS7细胞的ERK磷酸化才明显被抑制。【结论】EGF介导的ERK磷酸化水平在细胞分裂间期高于分裂期;抑制EGFR活性后可影响ERK磷酸化,但这种作用存在细胞差异性。

EGFR在大鼠呼吸机肺损伤中的作用研究

目的研究呼吸机所致肺损伤中表皮生长因子受体(EGFR)的激活作用。方法 24只清洁级雄性SD大鼠按照是否AG1478处理和是否机械通气将其分为DMSO自主呼吸组(n=6)、DMSO机械通气组(n=6)、AG1478 10mg/kg处理自主呼吸组(n=3)、AG1478 50mg/kg处理自主呼吸组(n=3)、AG1478 10mg/kg处理机械通气组(n=3)和AG1478 50mg/kg处理机械通气组(n=3)。20%乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠;自主呼吸的大鼠不作处理,机械通气的大鼠接小动物呼吸机行机械通气,机械通气参数设置为潮气量(Vt)20ml/kg,呼吸频率40次/min,吸呼比(I∶E)为1∶2,呼气末正压通气(PEEP)为0,吸入气体为室内空气。皮下切开行股静脉穿刺置管,监测动脉血压、心率等。4h后处死,分别收集肺组织、肺灌洗液标本。结果 AG1478 50mg/kg处理机械通气组与DMSO机械通气组相比蛋白渗漏更低,而且比AG1478 10mg/kg机械通气更低,差异均有统计学意义(P<0.05);细胞数量分析显示,AG147850mg/kg处理机械通气组与DMSO机械通气组相比中性粒细胞更低,而且比AG1478 10mg/kg处理自主呼吸组更低,差异均有统计学意义(P<0.01);AG1478 50mg/kg处理的大鼠巨噬细胞数量显著升高,均高于其他处理手段的大鼠。同样行机械通气的大鼠,AG1478组的肺血管渗漏水平与DMSO组相比更低。结论呼吸机相关肺损伤中,EGFR路径调节呼吸机诱导的肺损伤和与之相关的炎性反应,EGFR具有活化信号的作用,可调节呼吸机诱导的肺血管渗漏。