应用篮式生物反应器培养1A_5杂交瘤细胞及单克隆抗体分泌

目的 为了提高体外培养的杂交瘤细胞单克隆抗体的合成分泌，并为治疗型人源化单克隆抗体生 产摸索条件。方法 应用５Ｌ篮式及非篮式生物反应器培养１Ａ５杂交瘤细胞，以分泌干扰素单克隆抗体，从中对 １Ａ５细胞的接种浓度、反应动态、培养方式等进行研究。结果 细胞最适的接种浓度为２．０×１０５／ｍｌ左右；同非篮式 培养相比，在篮式培养过程中，通过葡萄糖消耗率的监测，及时地调节培养条件及换液时间，延长了培养周期，增加 了每罐收液批次，并且每次是全量换液，最高收液效价为１：４０９６。结论（１）１Ａ５ 细胞分泌干扰素单抗属于负生长 耦连型，葡萄糖消耗率与细胞的生长呈线性关系，可以利用糖消耗率的变化判断篮式生物反应器中细胞生长状况； （２）篮式生物反应器载体培养优于非篮式生物反应器悬浮培养；（３）适当地增加培养基中葡萄糖的量，可以提高干 扰素单抗的合成分泌。

一种篮式生物反应器内Vero细胞计数方法的建立

传统的篮式生物反应器因构造特殊,在进行Vero细胞培养时,无法取样进行直接细胞计数。实验通过活细胞计数仪,采用双电极电容法直接测量反应器内的活Vero细胞释放的电容,并将其转换为细胞数量,建立一种间接进行Vero细胞计数的方法。通过反应器内Vero细胞生长繁殖所消耗的葡萄糖量来计算所获得的细胞数,对篮式生物反应器Vero细胞培养阶段进行控制。结果表明,Vero细胞在生物反应器内培养5d,累积消耗葡萄糖230g,所获得的细胞数为1.2×10^(11)~1.3×10^(11)个。建立了Vero细胞数与葡萄糖消耗之间的关系,即每消耗1g葡萄糖可供5.345×10~8个Vero细胞生长。

篮式生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗

目的建立篮式生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的工艺。方法利用7.5L篮式生物反应器和片状载体培养Vero细胞,接种乙型脑炎病毒P3V2株毒种,根据葡萄糖的消耗量,分析细胞的生长情况及调节病毒培养时的灌流速度,每24h取样,检测病毒滴度。收获的病毒液经纯化后,制备乙脑灭活疫苗,检测各项指标。结果Vero细胞培养至96h,葡萄糖消耗量达高峰,细胞密度达峰值;接种病毒后72h,葡萄糖消耗量达高峰,灌流量为7L/d,连续收获7～9d,共可收获(40±5)L病毒液;96h病毒滴度达高峰,为10.0LgLD50/ml;制备的乙型脑炎灭活疫苗各项指标均达到《中国药典》三部(2005版)要求。结论已建立了篮式生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的工艺。

应用篮式生物反应器在BSL-3实验室进行病毒培养的评估

目的对篮式生物反应器在BSL-3实验室进行高致病性病毒培养的风险点加以评估,通过对病毒接种、培养、收获3个阶段环境中病毒浓度的监测判断其在BSL-3实验室病毒培养的安全性。方法用灭菌的拭子在病毒的接种、培养、收获3个阶段对篮式生物反应器的罐体及连接处进行涂抹采样,同时在安全柜中,用AirPort MD8空气采样器对病毒的接种和收获操作过成进行空气采样,并且对在3个阶段操作后,实验人员的个人防护装备进行涂抹采样,3种方式进行监测。结果在病毒接种、培养、收获3个阶段,篮式生物反应器的罐体及连接处采样病毒检测结果均为阴性,在病毒接种和收获操作过程中的空气采样病毒检测结果均为阴性,实验人员个人防护装备采样的病毒检测结果均为阴性。结论在BSL-3实验室采用篮式生物反应器进行病毒培养的方法是安全可靠的,通过检测结果显示其在整个操作过程中,未有病毒的泄露,进而确保了实验人员和实验室内环境的生物安全。

篮式生物反应器培养Sabin株脊髓灰质炎病毒工艺的建立

目的建立篮式生物反应器培养Sabin株脊髓灰质炎病毒的工艺。方法对细胞接种密度、载体装量、培养基种类、病毒培养温度、pH、MOI等培养条件进行优化,通过测定葡萄糖消耗量、病毒滴度、宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)残留量,分析并确定脊髓灰质炎病毒的最适培养工艺参数。结果载体装量400~600 g,细胞接种密度1×10^6个/mL时,葡萄糖消耗量最大,平台期持续2~3 d,此时细胞接种病毒最佳。以0. 01~0. 3 MOI接种Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒,采用199培养基于(33±0. 5)℃,pH 7. 4~7. 6条件下培养时,病毒滴度最高,HCP残留量较低,为最适培养工艺。结论初步建立了基于篮式生物反应器的脊髓灰质炎病毒高效制备工艺。

不同病毒培养方式制备森林脑炎灭活疫苗的比较

目的比较3 L转瓶及14 L篮式生物反应器培养病毒制备的森林脑炎灭活疫苗的产量及质量。方法分别采用3 L转瓶及14 L篮式生物反应器培养Vero细胞,3 L转瓶培养细胞96 h后感染SZV株森林脑炎病毒(MOI=0.01、0.04、0.1及0.4),培养至80~96 h收获第1次,每隔48 h收获1次(500 m L/次);14 L生物反应器培养Vero细胞7 d后感染SZV株森林脑炎病毒(MOI=0.01、0.04、0.1及0.4),感染后96 h开始流加病毒维持液,并收获病毒液,每24 h收获10~15 L。两种培养方式收获的森林脑炎病毒液经超滤浓缩、β-丙内酯灭活、柱层析纯化后获得疫苗原液,并进行相关检定。结果 4种MOI感染Vero细胞,采用3 L转瓶方式培养可连续收获6~7次,病毒液产量为3~3.5 L,收获液平均滴度为7.4 lgLD_(50)/m L;采用14 L篮式生物反应器培养可连续收获14 d,病毒产量140~160 L,收获液平均滴度高达8.4 lgLD_(50)/m L。两种方法制备森林脑炎灭活疫苗原液各项质量指标均合格,且14 L篮式生物反应器制备原液的效力及蛋白含量优于3 L转瓶。结论应用生物反应器培养工艺制备Vero细胞森林脑炎灭活疫苗的产量及质量高于转瓶培养工艺,本实验为生物反应器制备Vero细胞森林脑炎灭活疫苗的大规模生产及工艺改进奠定了基础。