下调HPV16 E6/E7表达宫颈癌细胞Siha上清液代谢组学

目的 基于核磁共振氢谱(1H NMR)代谢组学筛选抑制HPV16 E6/E7表达,检测宫颈癌Siha细胞中差异代谢物以及相关通路,以明确感染高危型HPV16宫颈癌发生的关键代谢标志物。方法 通过RNAi片段转染Siha细胞下调E6/E7表达,分为正常对照组(Siha细胞)、空载组(si-NON)、si-E6组与si-E7组,并验证其转染效率。利用1H NMR代谢组学技术揭示干扰Siha细胞中E6/E7表达后所涉及的差异代谢物;结合MetaboAnalyst 5.0在线软件,得到改变的差异性代谢物和相关的代谢途径。结果 荧光倒置显微镜观察细胞荧光存在;Western blotting检测结果显示,与Siha组比较,si-E6组与si-E7组中E6/E7的表达量降低(F=145.8,P<0.001);下调E6/E7表达后,检测13种共有差异代谢物,包括异亮氨酸(Isoleucine),亮氨酸(Leucine),缬氨酸(Valine);MetaboAnalyst 5.0在线软件分析结果提示,以上代谢物主要涉及氨酰-tRNA生物化学合成途径;异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的生物化学合成途径;酪氨酸、苯丙氨酸以及色氨酸的生物化学合成等10条代谢途径。结论 HPV16感染后通过改变葡萄糖及氨基酸相关代谢促进宫颈癌的进展,为宫颈癌的防治提供理论依据。

p16/Ki-67双染检测、HPVE6/E7mRNA检测在宫颈病变诊断中的价值研究

目的:探讨p16/Ki-67双染检测、HPVE6/E7mRNA检测在宫颈病变诊断中的价值。方法:选择2021年4月至2023年2月我院收治的605例高危型HPV阳性患者为研究对象,所有患者入院后均进行阴道镜检查与病理活检,取患者细胞学样本分别进行p16/Ki-67双染检测、HPVE6/E7mRNA检测。比较两种方法单独检查与联合检测对宫颈病变阳性检出率的差异;比较三种检查方法对宫颈病变诊断效能的差异。结果:联合检测检出CIN1~3阳性率均高于p16/Ki-67双标记、HPVE6/E7mRNA检测(P<0.05);三种检测方式的浸润癌阳性检出率比较无明显差异(P>0.05)。Kappa检验分析结果显示,p16/Ki-67双标记与HPVE6/E7mRNA检查结果与病理诊断结果具有较好的一致性(Kappa值=0.719,P<0.05);联合检测结果与病理诊断结果具有高度的一致性(Kappa值=0.894,P<0.05)。联合检测对宫颈病变的诊断灵敏度、特异性与准确率高于p16/Ki-67双标记与HPVE6/E7mRNA检查(P<0.05)。结论:p16Ki-67双染与HPVE6/E7mRNA联合检测可准确检出宫颈病变程度,对宫颈病变疾病类型的鉴别可提供充足可靠的数据支持,联合检查的诊断效能较好,对患者后续相关治疗开展有积极指导意义。

HPV16-E6、ID-1及Pin1在宫颈癌组织中的表达及相关性分析

目的:分析人乳头瘤病毒16型E6蛋白(Human papillomavirus type 16 E6 protein,HPV16-E6)、细胞分化抑制因子-1(Inhibitor of intracellular differentiation-1,ID-1)及脯氨酰顺反异构酶1(Prolylcis-trans isomerase1,Pin1)在宫颈癌组织中的表达及相关性。方法:选择2017年3月至2022年3月莆田学院附属医院收治的宫颈癌65例,所有患者均在我院进行手术切除癌组织,并留取宫颈癌组织和距离癌组织边缘2 cm以上癌旁组织。通过免疫组化法对癌组织、癌旁组织标本HPV16-E6、ID-1、Pin1阳性表达率进行检测。分析HPV16-E6、ID-1、Pin1与临床特征的关系。结果:与癌旁组织相比,癌组织中HPV16-E6、ID-1、Pin1阳性率较高(P<0.05)。HPV16-E6、ID-1、Pin1与肌层浸润深度、组织学分级、临床分期、淋巴结转移、肿瘤直径呈正相关(P<0.05)。将年龄、病理类型等因素控制后,HPV16-E6、ID-1、Pin1与肌层浸润深度、组织学分级、临床分期、淋巴结转移、肿瘤直径相关(P<0.05)。结论:HPV16-E6、ID-1、Pin1在宫颈癌患者中均呈高表达,且HPV16-E6、ID-1、Pin1与宫颈癌患者肌层浸润深度、组织学分级、临床分期、淋巴结转移、肿瘤直径相关。

人乳头瘤病毒16型E7基因靶向调控cGAS-STING信号通路抑制宫颈癌细胞免疫功能的研究

目的:探讨HPV16 E7靶向调控cGAS-STING信号通路对宫颈癌细胞免疫功能的影响。方法:体外构建HPV16 E7过表达和干扰质粒,转染至SiHa细胞,qPCR检测HPV16 E7 mRNA表达水平,流式细胞术检测CD95、MICA/B、CD73、CD39、CTLA-4和CD25表达。在此基础上分别转染cGAS-siRNA和STING-siRNA至SiHa细胞,CCK8检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡。qPCR和Western blot分别检测cGAS、STING、IFN-Ⅰ、HPV16 E7的mRNA及蛋白表达。流式细胞术检测细胞CD95、MICA/B、CD73、CD39、CTLA-4和CD25表达。结果:STING-siRNA+HPV16 E7过表达组CD95和MICA/B水平降低(P<0.05),CD73、CD39、CTLA-4和CD25水平升高(P<0.05)。cGAS、STING和IFN-Ⅰ蛋白表达水平降低(P<0.05)。STINGsiRNA+HPV16 E7干扰组结果与之相反。结论:HPV16 E7靶向调控cGAS-STING信号通路进而抑制宫颈癌细胞免疫功能。

PRDX2调控HPV16 E6对宫颈癌Siha细胞活性的影响

目的探究PRDX2在宫颈癌组织中的表达以及对宫颈癌Siha细胞的恶性生物学行为的影响。方法免疫组化方法检测宫颈癌组织以及癌旁组织中PRDX2的表达;将宫颈癌Siha细胞设置为4个组:Siha组、siRNA NC组、siRNA PRDX2组与siRNA HPV16 E6组。EDU染色法检测Siha细胞的生长活性;Transwell实验方法分析Siha细胞的侵袭数量;流式细胞术检测Siha细胞的凋亡情况;蛋白免疫印迹方法分析Siha细胞中PRDX2/HPV16 E6蛋白的表达水平。结果与宫颈癌旁组织比较,宫颈癌组织PRDX2的表达上调。与Siha组和siRNA NC组比较,siRNA PRDX2和siRNA HPV16 E6组的Siha细胞增殖能力下降(P<0.05);siRNA PRDX2和siRNA HPV16 E6组的Siha细胞侵袭数量下降(P<0.05);siRNA PRDX2和siRNA HPV16 E6组的Siha细胞凋亡率增加(P<0.05);siRNA PRDX2组的Siha细胞的HPV16 E6蛋白表达下调(P<0.05)。结论PRDX2在宫颈癌组织中表达增加,抑制PRDX2表达后,Siha细胞的增殖速度与侵袭数量降低,凋亡率增加,该机制与PRDX2调节HPV16 E6蛋白的表达相关。

HPV16 E6-295T/G和E6-350T/G变异位点影响IFNκ、MHC-Ⅰ、STAT1和IRF9蛋白质表达的研究

目的探讨HPV16(Human Papillomavirus Type 16)E6-295T/G和E6-350T/G变异位点对IFNκ、MHC-Ⅰ、STAT1和IRF9蛋白质表达的影响。方法在宫颈癌细胞C33A(HPV阴性)中分别转染真核表达载体295G/350G-GV230、295T/350G-GV230和295T/350T-GV230作为实验组,以NC-GV230作为对照组。通过免疫组织化学法、Western blot方法检测HPV16 E6295T/G、350T/G不同变异位点对IFNκ、MHC-Ⅰ、STAT1和IRF9蛋白质表达的影响。通过IBM SPSS Statistics 26软件对实验结果进行统计学分析,P<0.05为差异具有统计学意义,免疫组织化学法定量采用image J软件进行阳性细胞计数。结果Western blot结果显示,免疫分子干扰素κ(Interferon Kappa,IFNκ)的表达,HPV16 E6-295G/350G变异组较HPV16 E6-295T/350T原型组和HPV16 E6-295T/350G组降低(P<0.01,P<0.05)。HPV16 E6-295G/350G变异组的免疫分子主要组织相容性复合体I类(Major Histocompatibility Complex Class I,MHC-I)的表达显著低于HPV16 E6-295T/350T原型组和HPV16 E6-295T/350G组(P<0.05)。HPV16 E6-295G/350G变异组的信号转导子和转录激活子1(Signal Transducer and Activator of Transcription 1,STAT1)表达显著低于HPV16 E6-295T/350T原型组和HPV16 E6-295T/350G组(P<0.05,P<0.01)。变异组HPV16 E6-295G/350G与HPV16 E6-295T/350T原型组和HPV16 E6-295T/350G变异组相比,干扰素调节因子9(Interferon Regulatory Factor 9,IRF9)表达显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论HPV16病毒E6蛋白质可以降低IFNκ、MHC-Ⅰ、STAT1和IRF9的蛋白质表达水平,E6基因T295G/T350G变异降低这些分子的表达作用最强。

HPV16 E6、E7多表位DNA疫苗的构建及免疫效果评估

目的构建和评价HPV16 E6、E7多表位DNA疫苗诱导的特异性CTL细胞应答及其对肿瘤生长的干预作用,从而揭示其作为候选HPV治疗性疫苗的潜能。方法首先通过IEDB网站中的MHC I Processing Predictions和MHC I Binding Predictions方法,分别预测人类HLA-A^(*)02:01、HLA-A^(*)11:01、HLA-A^(*)24:02和C57BL/6小鼠H-2b的限制性CTL表位,然后根据评分以及ELISPOT实验筛选出二者共同呈递的CTL表位,并将其构建成多表位DNA疫苗(pVAX1-10P)。从预防性和治疗性二个方面研究pVAX1-10P对小鼠移植TC-1异位癌的免疫干预作用,流式细胞术检测特异性CTL应答。结果获得10条可被人与鼠MHC分子共呈递的CTL表位,ELISPOT结果表明这10条CTL表位均能诱导小鼠淋巴细胞产生特异性免疫应答;由此构建的多表位DNA疫苗pVAX1-10P无论在预防性实验还是治疗性实验中,均能诱导特异性的细胞免疫并抑制肿瘤的生长。结论构建的HPV16 E6、E7多表位DNA疫苗pVAX1-10P能够诱导特异性CTL应答,显著抑制肿瘤生长,有望作为候选HPV治疗性DNA疫苗。

E16-25MoN焊丝熔敷金属高温失塑裂纹敏感性及微观组织分析

采用钨极氩弧焊制备了E16-25MoN焊丝熔敷层,采用Gleeble热模拟试验机对熔敷金属试样进行了不同温度、不同应变量的拉伸试验。结果表明:在850~1150℃内,E16-25MoN焊丝熔敷金属的高温失塑裂纹敏感程度较高,1000℃时敏感程度最高,该温度下裂纹临界应变量变低于6%。通过组织分析发现高温失塑裂纹的产生受晶界平直形貌和晶界析出物的影响,高温时晶界上析出物阻碍位错移动,形成应力集中最终产生开裂,而平直晶界为裂纹扩展提供了有利条件。

HPV16 E6调控miR-23a表达促进宫颈癌细胞侵袭、迁移

目的探讨高危型人乳头瘤病毒16 E6蛋白(HPV16 E6蛋白)调控miR-23a表达对宫颈癌细胞SiHa侵袭、迁移的作用。方法选取100例宫颈癌HPV阴性患者、100例HPV阳性患者的组织标本、100例癌旁正常组织;宫颈癌SiHa细胞分为空白组、E6过表达组、阴性转染组、E6+miR-23a mimics组;qRTPCR法检测miR-23a、HPV16 E6 mRNA表达;MTT法检测增殖抑制率;流式细胞仪检测凋亡;Transwell小室实验检测细胞侵袭;划痕实验检测细胞迁移;WB检测HPV16 E6、凋亡相关蛋白(Caspase-3、Bax、Bcl-2)、迁移相关蛋白(MMP-2、MMP-9)的表达。结果宫颈癌组织中miR-23a表达降低,其中宫颈癌HPV阳性组织中miR-23a表达水平更低。E6过表达降低miR-23a表达水平、细胞增殖抑制率、凋亡率、Caspase-3、Bax蛋白表达,增高Bcl-2蛋白、划痕愈合率、侵袭细胞数、MMP-2、MMP-9蛋白表达(P<0.05);miR-23a mimics逆转了E6过表达对上述各项指标的影响。结论HPV16 E6促进宫颈癌细胞侵袭、迁移可能与调控miR-23a表达有关。

Tmem16a、E-cadherin、SIRT1在眼睑基底细胞癌中的表达及其临床意义

目的分析跨膜蛋白16a(Tmem16a)、钙黏蛋白E(E-cadherin)、沉默信息调节因子1(SIRT1)在眼睑基底细胞癌中表达水平及其临床意义。方法将70例经病理检查证实为眼睑基底细胞癌患者手术切除的癌组织纳入研究组,其癌周正常组织纳入对照组。术后随访36个月观察复发情况。比较癌组织及癌周正常组织中Tmem16a、E-cadherin、SIRT1表达水平,不同性别、年龄、不同病理特征患者癌组织中Tmem16a、E-cadherin、SIRT1表达水平,癌组织中Tmem16a、E-cadherin、SIRT1表达水平与复发的关系。结果癌组织中Tmem16a、E-cadherin、SIRT1表达水平高于癌周正常组织(P<0.05)。相比年龄≤60岁的眼睑基底细胞癌患者,年龄≥60岁的患者癌组织中Tmem16a、E-cadherin、SIRT1表达水平更高(P<0.05)。肿瘤体积≥3 cm^(3)、脉管侵犯、分化的眼睑基底细胞癌患者癌组织Tmem16a、E-cadherin、SIRT1表达水平更高(P<0.05)。癌组织中Tmem16a阳性表达眼睑基底细胞癌患者复发率为44.44%(16/36),高于阴性表达患者[20.59%(7/34)],P<0.05;癌组织中E-cadherin阳性表达眼睑基底细胞癌患者复发率为56.67%(17/30),高于阴性表达患者[15.00%(6/40)],P<0.05;癌组织中SIRT1阳性表达眼睑基底细胞癌患者复发率为40.00%(22/55),高于阴性表达患者[6.67%(1/15)],P<0.05。结论眼睑基底细胞癌患者癌组织Tmem16a、E-cadherin、SIRT1阳性表达水平更高,其表达与其病理特征、年龄、复发情况密切相关,可为评估病情进展和预后提供参考。

HPV16 E6 下调 DHRS2 表达可介导宫颈上皮细胞的致癌转化

目的探讨HPV16 E6对宫颈上皮细胞基因及信号通路的影响,筛选与致癌转化相关的基因。方法构建HPV16 E6感染的正常人宫颈上皮细胞(HUCEC)模型,进行转录组测序筛选差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),并进行基因本体(Gene Ontology,GO)和京都基因和基因组(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析差异信号通路。采用RT-qPCR验证主要差异下调表达基因。对主要差异基因的蛋白结构与HPV16 E6蛋白进行分子对接预测分析,通过RT-qPCR及Western blot验证HUCEC细胞模型中主要差异基因表达情况,并采用RT-qPCR及Western blot实验在宫颈癌细胞系SiHa及CaSki中进一步验证差异基因的表达。结果共筛选出差异表达2倍以上的基因55个。本研究聚焦下调差异基因,结果表明:负调控的差异基因GO功能富集于氧化还原过程;KEGG富集分析主要与碳水化合物代谢及癌症等相关。10个差异基因mRNA下调表达趋势与测序结果基本一致。分子对接预测DHRS2与HPV16 E6蛋白存在相互作用。与对照组比较,HUCEC细胞模型中HPV16 E6下调DHRS2的mRNA(P<0.01)和蛋白(P<0.05)、ETV5的蛋白(P<0.01)表达;在SiHa、CaSki细胞系中,与对照组比较,DHRS2的mRNA及蛋白表达亦明显下调(P<0.05),并与P53蛋白表达趋势正相关。结论HPV16 E6可能通过下调DHRS2表达介导宫颈细胞致癌转化,促进宫颈癌发生。

宫颈癌组织Survivin、HPV16E7水平与患者临床病理特征、预后及化疗敏感性的关系研究

目的:探究宫颈癌(CC)组织生存蛋白(Survivin)、人乳头瘤病毒16型E7基因片段(HPV16E7)水平与患者临床病理特征、预后及化疗敏感性的关系。方法:选取2020年7月—2022年4月联勤保障部队第九八九医院平顶山医疗区收治的118例CC化疗患者作为研究对象,检测组织Survivin、HPV16E7表达情况,并分析其与临床病理特征、总生存期(OS)、化疗敏感性的关系。结果:组织Survivin阳性表达与FIGO分期、组织分化、淋巴结转移具有密切的相关性,组织HPV16E7阳性表达与FIGO分期相关,差异均有统计学意义(χ^(2)=23.741、18.819、15.311、7.715,P<0.05)。不同分期下,OS<6个月患者组织HPV16E7阳性表达率均高于OS≥6个月患者,差异均有统计学意义(χ^(2)=6.667、6.089,P<0.05)。化疗敏感患者组织Survivin、HPV16E7阳性表达率均低于化疗抵抗患者,差异均有统计学意义(χ^(2)=23.248、7.859,P<0.05)。Survivin与HPV16E7mRNA表达水平呈正相关(r=0.326,P<0.05)。结论:CC组织Survivin、HPV16E7水平与患者临床病理特征、预后及化疗敏感性具有密切的相关性。

HPV E6/E7mRNA检测与P16/Ki-67免疫组化检测对宫颈CIN2级病变的筛查价值探究

目的:研究人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)E6/E7mRNA与免疫组化抑癌基因P16/细胞增殖核抗原Ki-67在宫颈上皮内瘤样病变(Cervical intraepithelial neoplasia,CIN)2级病变筛查中的应用价值。方法:选取2020年2月至2023年2月期间本院收治的92例宫颈炎症及病变患者作为研究对象。根据病理检查结果,将CIN2级患者纳入研究组(n=45),宫颈CIN1级和宫颈炎患者纳入对照组(n=47)。对比两组HPV E6/E7mRNA、P16/Ki-67单独及联合检测阳性表达率差异,采用Logistic回归分析影响CIN2诊断的危险因素,并采用受试者工作曲线分析HPV E6/E7mRNA与P16/Ki-67单独及联合检测在宫颈CIN2级病变筛查的价值。结果:研究组HPV E6/E7mRNA、P16/Ki-67单独检测阳性率、联合检测阳性率(82.22%,77.78%,84.44%)高于对照组(63.83%,48.94%,53.19%)(P<0.05)。Logistic回归分析显示HPV E6/E7mRNA、P16/Ki-67是影响CIN2诊断的危险因素(P<0.05);HPV E6/E7mRNA、P16/Ki-67联合检测CIN2级病变的受试者工作特征曲线下面积为0.688(95%CI:0.579~0.798),优于HPV E6/E7mRNA、P16/Ki-67单独预测[0.592(95%CI:0.476~0.708);0.634(95%CI:0.519~0.748)]。联合检测的准确度、灵敏度、特异度(68.8%,84.4%,53.2%)均高于单独检测HPV E6/E7mRNA(59.2%,82.2%,36.2%)、P16/Ki-67(63.4%,77.8%,48.9%)。结论:HPV E6/E7mRNA与P16/Ki-67免疫组化检测在宫颈CIN2级病变筛查中具有一定的应用价值,可以显著提高筛查宫颈CIN2级病变的诊断效能。

Q345R双层堆焊E309L-16的焊接工艺和性能研究

在催化裂化装置稳定塔产品研发过程中,为了确保压力容器能够安全、平稳、长周期地运行,按照产品技术要求进行了相关焊接工艺试验。采用手工电弧焊(SMAW)对Q345R钢板表面进行局部双层堆焊E309L-16,并按照产品技术要求开展了相关焊接工艺试验。试验结果表明,堆焊试板在(610±10)℃的去应力退火后,其堆焊层的力学性能均能满足产品技术条件要求。

MS16E020 A/D转换芯片采用外部基准源REF5025和MAX6325的对比测试分析

针对MS16E020 A/D转换芯片,通过对其采用外部基准源REF5025和MAX6325进行对比测试,分析了两种基准源在性能、精度、稳定性等方面的优劣。测试结果表明,MAX6325基准源表现出更好的性能和稳定性,为工程师在选择外部基准源时提供了有价值的参考。

纳米雄黄混悬液诱导Siha细胞凋亡及对HPV16E6/E7表达的影响

目的：探讨纳米雄黄混悬液对人宫颈癌Siha细胞的抑制增殖、诱导凋亡作用及其对HPV16E6和E7致瘤基因的影响。方法：采用微射流法制备纳米雄黄混悬液,应用不同质量浓度（6.25,12.5,25,50 mg.L^-1）的纳米雄黄混悬液作用于Siha细胞不同时间（12,24,48,72 h）,光镜和透射电镜观察实验组（不同质量浓度的纳米雄黄混悬液处理组）和对照组（不加药物的细胞）细胞的形态学变化;琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞DNA Ladder形成;MTT比色法测定细胞生长抑制情况;流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期改变;RT-PCR方法检测HPV16E6和E7的表达。结果：纳米雄黄混悬液25~50 mg.L-1处理Siha细胞48,72 h后,细胞存活率降低,凋亡增加,作用呈时间-剂量依赖关系。电镜显示细胞呈典型的凋亡形态学改变,琼脂糖凝胶电泳显示凋亡细胞DNA Ladder形成;流式细胞术检测证实细胞凋亡率与纳米雄黄混悬液作用浓度呈明显相关,与对照组相比,差异有极显著意义（P〈0.01）,且细胞呈G0-G1期阻滞。RT-PCR检测显示随着纳米雄黄混悬液作用浓度的增加,HPV16E6和E7的表达不同程度地受到抑制。结论：纳米雄黄混悬液对于Siha细胞具有诱导凋亡、抑制增殖的作用,其机制可能与其抑制HPV16E6和E7致瘤基因的表达有关。

HPV16型-E6、E7在食管鳞癌组织与非癌组织中的表达

背景与目的:越来越多的证据表明高危型人乳头状瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV),特别是HPV16型与多种肿瘤发生、发展密切相关。本研究旨在分析人乳头状瘤病毒HPV16型E6、E7在食管正常组织、不典型增生组织和癌组织中的表达,以探讨HPV16型在食管鳞癌发生、发展中的生物学意义。方法:采用PicTureTM免疫组织化学方法对70例食管癌切除标本上、下切缘的正常粘膜上皮组织、43例不典型增生组织以及18例癌组织中的HPV16型E6、E7蛋白表达情况进行研究。结果:E6蛋白阳性率在正常食管粘膜上皮组织中为59.3%,在上皮不典型增生组织中为88.4%,在癌组织中为83.3%;E7蛋白在上述3种组织中的阳性率分别为62.1%、90.7%和88.9%。与正常食管粘膜上皮相比,上皮不典型增生组织和癌组织中E6、E7蛋白表达均有显著性差异(P<0.05)。HPV16型E6、E7蛋白在正常食管粘膜组织中同时表达即同步率为25.7%,而在上皮不典型增生组织和癌组织中二者同步率分别为88.3%和83.3%。结论:HPV16型E6、E7蛋白与食管鳞癌发生、发展密切相关,二者协同作用可能是食管鳞癌发生、发展的重要因素之一。

人乳头瘤病毒16型E6、E7反义RNA对人宫颈癌SiHa细胞的恶性逆转作用

背景与目的:人乳头瘤病毒16型(humanpapillomavirus16,HPV16)的早期基因E6、E7可分别诱导p53的泛素化降解和pRb的高磷酸化失活,与宫颈癌的发生发展关系密切。本研究通过真核表达载体介导HPV16型E6、E7基因反义RNA在SiHa细胞中的表达,探讨反义RNA能否降低E6、E7基因的表达和诱导细胞凋亡。方法:利用pEGFP构建HPV16型E6、E7基因反义RNA的真核表达载体并转染SiHa细胞,利用RT-PCR和Westernblot技术检测转染后E6、E7基因的mRNA和蛋白的变化,利用MTT法检测SiHa细胞转染后细胞增殖活性,利用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测转染后细胞的凋亡情况。结果:转染携带HPV16型E6、E7反义基因的质粒后,SiHa细胞的E6、E7基因的mRNA和蛋白表达均明显下调;MTT结果显示转染后细胞的增殖活性(0.50±0.05)与转染空载体细胞(1.01±0.06)和未转染细胞(1.28±0.06)比较明显降低(P<0.05);流式细胞仪检测结果显示转染后细胞凋亡率(59.3±11.3)%与转染空载体细胞(9.4±1.8)%和未转染细胞(2.1±0.4)%比较有显著性差异(P<0.05)。激光共聚焦显微镜结果示转染后细胞凋亡明显增多。结论:HPV16型E6、E7基因反义RNA可降低宫颈癌细胞中E6、E7癌基因的表达,诱导宫颈癌细胞凋亡。

RNA干涉抑制宫颈癌CaSki细胞株HPV16 E6基因的研究

背景与目的:研究表明宫颈癌的发生发展与人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)E6、E7癌基因密切相关,于是人们采用核酶或HPVE6、E7反义寡核苷酸抑制其表达来治疗宫颈癌,虽然取得了一定的效果,但仍面临基因抑制效率低、维持时间短、工作量大、耗费多等问题。本研究采用最新的RNA干扰技术干扰宫颈癌CaSki细胞中HPV16E6转录,以了解其能否特异性抑制HPV16E6基因及其时效性如何。方法:设计合成针对HPV16E6的荧光标记siRNA,借脂质体转染宫颈癌CaSki细胞,通过荧光照片计数荧光细胞占所有细胞的比例计算转染效率;测定转染后不同时间点的细胞凋亡率;RT-PCR测定HPV16E6mRNA变化,Westernblot和流式细胞仪检测转染前后蛋白表达情况。结果:相差显微镜荧光照片显示细胞转染的效率为81%。HPV16E6siRNA转染细胞后24h、48h、5天凋亡率分别为7.7%、11.8%和37.4%,转染9天时凋亡率下降至12.6%。RT-PCR扩增结果显示,细胞转染前HPV16E6mRNA的量与siRNA阴性对照比较没有显著性差异,但转染后24h、48h、5天和9天分别减少了77%、83%、59%和41%;而作为内对照的β-actinmRNA在转染前后无变化。流式细胞仪定量测定HPV16E6蛋白,结果显示转染后24h、48h和5天,蛋白表达抑制率分别为79.7%、80.4%和71.3%;9天时抑制率有下降,但仍可达57.

新疆维、汉族宫颈鳞癌病变中HPV16 E6基因变异分析

目的分析新疆地区维、汉族妇女宫颈鳞癌组织中HPV16型E6基因的变异情况。方法从新疆地区5例维吾尔族妇女和5例汉族妇女宫颈活检组织中提取病毒基因组DNA,经反向膜杂交检测确定为HPV16单一感染。采用PCR技术扩增HPV16E6基因片段,克隆到pUC18-T载体中进行DNA测序。结果成功克隆了HPV16E6基因,DNA测序结果表明,与德国标准株相比,10例宫颈鳞癌组织中共检出12种E6基因突变类型,包括107(T→C)、133(A→C)、168(C→G)、178(T→G)、310(T→C)、321(T→C)、341(T→C)、350(T→G)、375(A→G)、410(T→A)、499(G→T)和548(A→G),其中178(T→G)和350(T→G)的突变频率较高,均为30%(3/10)。汉族和维吾尔族标本中共有的突变包括178(T→G)和350(T→G),仅存在于汉族标本的突变为107(T→C)、133(A→C)、168(C→G)、310(T→C)和499(G→T),仅发生在维吾尔族标本的突变为321(T→C)、341(T→C)、375(A→G)、410(T→A)和548(A→G)。结论与德国标准株比较,新疆维吾尔族、汉族宫颈癌患者中HPV16E6基因存在新的变异,其中178(T→G)和350(T→G)型基因变异为热点突变;新疆地区宫颈癌的高发可能与HPV16E6基因突变有关。