脑梗死大鼠经血管内皮生长因子165基因治疗后热休克蛋白70的表达

目的观察脑梗死大鼠经血管内皮生长因子(VEGF)165基因治疗后热休克蛋白70(HSP70)的表达。方法将25只大鼠随机均分为以下5组:正常对照组(A组);假大脑中动脉闭塞(MCAO)组(B组);MCAO组;空载质粒对照组(D组);hVEGF165基因治疗组(E组)。建模7 d后采用免疫组化的方法观察各组动物脑组织中的HSP70 的表达。结果(1)在皮质中,A、B两组HSP70均低表达(P>0.05);C、D两组表达均较高(P>0.05),与A、B两组相比有较显著的差异(P<0.01);E组表达最强,与各组相比均有显著差异(P<0.01)。(2)在半暗带中,C、D、E各组HSP70 表达均较高,C、D两组间无显著差异(P>0.05),而E组显著高于C、D组(P<0.01)。(3)在梗死灶内,E 组表达较高,显著高于C、D组(P< 0.01)。结论经hVEGF165基因治疗的脑梗死大鼠HSP70表达显著增高,提示VEGF165基因可诱导HSP70的表达。

热休克蛋白90^ α在血管内皮生长因子165基因治疗大鼠脑梗死中的表达及意义

目的观察热休克蛋白(HSP)90^ α在血管内皮生长因子(VEGF)165基因治疗大鼠脑梗死中的表达，为治疗脑梗死提供实验依据。方法雌性Wistar大自鼠25只，体重为250～300g，随机分为5组，每组5只。正常对照组(A组)予常规饲养；假手术组(B组)在建立大脑中动脉闭塞(MCAO)模型过程中，仅将栓线插入颈内动脉约1cm即可；单纯MCAO对照组(C组)，采用改进的线栓法制成永久性MCAO模型；空载质粒对照组(D组)在MCAO模型术后，头顶部剃毛，消毒后采用立体定位仪在梗死区相应部位钻一小孔，以5μl空载质粒(pUCCAGGS，20μg／μl)，然后缝合切口，精心饲养；治疗组(E组)的方法同D组。注入等量的pUCCAGGS／hVEGF165取代空载质粒。实验7d后断头取脑，采用免疫组织化学的方法显示脑中的hSP90^ α表达情况。结果A、B两组整个脑部均无HSP90^ α表达；C、D两组仅有少量表达；E组的半暗带内有明显表达，与C、D组的差异有显著性(P<0．01)，半暗带以外区域仅有少量表达或不表达。结论VEGF165基因可诱导HSP90^ α在特定部位表达。

人血管内皮生长因子165基因联合间充质干细胞治疗对扩张型心肌病胶原重塑的影响

目的:探讨人血管内皮生长因子165基因(hVEGF165)联合间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)治疗对扩张型心肌病胶原重塑的影响。方法:将40只扩张型心肌病(DCM)大鼠模型随机分为4组:PBS组、MSCs心肌移植联合基因治疗组(MSCs-GENE组)、MSCs心肌移植组(MSCs组)以及基因治疗组(GENE组)。心肌局部注射所构建MLC-2v/pIRES2-EG-FP-hVEGF165与MSCs,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测I型、Ⅲ型胶原和转化生长因子-β(TGF-β)基因表达,蛋白免疫印迹(Westren blot)检测hVEGF165蛋白表达。结果:PBS组、MSCs+GENE组、MSCs组以及GENE组的I型胶原PCR产物灰度比分别为(0.359±0.010)、(0.240±0.012)、(0.313±0.058)、(0.230±0.011);而Ⅲ型胶原分别为(0.831±0.011)、(0.842±0.015)、(0.917±0.058)、(0.688±0.015);TGF-β1分别为(0.548±0.067)、(0.370±0.012)、(0.561±0.014)、(0.369±0.098);MSCs+GENE组TGF-β1与GENE组比较差异无统计学意义,但两者显著低于PBS组和MSCs组,提示TGF-β1表达下调;I型/III型胶原灰度比分别为(0.436±0.072)、(0.290±0.023)、(0.337±0.021)、(0.333±0.011),其中MSCs组与GENE组比较差异无统计学意义;MSCs组与GENE组的I型/III型胶原灰度比减低,2组比较差异无统计学意义,但MSCs-GENE组进一步使I型/III型胶原灰度比减低;TGF-β1表达分析结果显示,hVEGF165基因治疗较MSCs移植使TGF-β1表达下调的作用更显著。结论:MSCs移植与hVEGF165基因治疗有可能通过下调TGFβ1表达,降低I型/III胶原比值,增加心肌顺应性,减轻心肌胶原网络重塑而改善心功能。

hVEGF165基因克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的克隆人血管内皮生长因子(hVEGF)基因VEGF165片段,构建pcDNA3.1/hVEGF165,观察其在COS-7细胞中的表达,为基因治疗缺血性心脏病的研究奠定基础。方法从合法引产的胎儿心肌组织中提取总核糖核酸(RNA),应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法获得hVEGF165基因,将其重组入T载体,聚合酶链反应(PCR)法鉴定并测序,双酶切后克隆入真核表达载体pcDNA3.1/myc-his-B中,构建pcDNA3.1/hVEGF165重组体。用脂质体介导将其转染COS-7细胞,蛋白印迹(Westernblotting)法检测rhVEGF165的表达蛋白。结果用RT-PCR方法从胎儿心肌组织中获得了正确的hVEGF165基因序列,并成功构建pcDNA3.1/hVEGF165,且实现转染COS-7细胞的瞬时表达。结论构建的pcDNA3.1/hVEGF165转染真核细胞COS-7能够表达rhVEGF蛋白。

血管内皮生长因子165基因对大鼠血管损伤后重塑的实验研究

目的探讨局部转染血管内皮生长因子165基因(VEGF165cDNA)对大鼠血管球囊拉伤术后血管重塑的影响。方法制备VEGF165cDNA基因,将30只SD大鼠随机分为基因组、手术对照组及正常对照组(各10只),基因组通过尾静脉输入VEGF165cDNA基因,手术对照组及正常对照组只注入生理盐水,应用免疫组织化学、电镜、光镜等方法观察球囊拉伤后的大鼠股动脉内膜的变化,检测拉伤局部内膜VEGF165基因作用效果。结果基因组球囊拉伤血管24 h后内膜处有少量中性粒细胞浸润,手术对照组损伤内膜有较多的中性粒细胞浸润,14 d后基因组球囊拉伤血管内膜厚度小于手术对照组(P<0.01),管腔内径大于手术对照组(P<0.01),内膜有大量VEGF蛋白表达。结论病理性重塑是血管损伤后再狭窄的主要原因,而VEGF165基因可促进内皮细胞增生,加速损伤内膜的修复,抑制血管内膜平滑肌细胞的增生进而防治再狭窄。

靶向hVEGF165基因shRNA质粒表达载体的构建及筛选

目的构建编码hVEGF165mRNA的shRNA质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体。方法以hVEGF165mRNA编码区中第5和第7外显子序列作为RNA干扰靶点,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体并通过PCR进行鉴定。经鉴定后分别转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞,实时荧光定量PCR和Western blotting分别从mRNA和蛋白质水平检测抑制效果。结果构建的质粒表达载体PCR鉴定均可扩增出预期条带,构建成功。靶向hVEGF165基因的shRNA对所转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞中hVEGF165基因mRNA和蛋白质表达均有抑制作用,其中shRNA2最为明显。结论成功构建了靶向hVEGF165基因的shRNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的shRNA质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2质粒。

VEGF165基因应用于鼠脑梗塞治疗的初步探讨

目的 探讨血管内皮生长因子165(VEGF165)基因对大鼠脑梗塞的治疗是否有作用，效果如何，为临床应用VEGF165基因提供依据。方法 用线栓法制成Wistar大鼠永久性大脑中动脉闭塞模型，将VEGF165基因与质粒载体构成重组DNA经颅注入到梗塞区。7d后断头取脑制成石蜡切片，用HE染色显示梗塞区，用图像分析仪测梗塞面积。结果 重组DNA治疗组梗塞体积显著缩小(P<0．01)。结论 VEGF165基因对鼠脑梗塞具有显著的治疗效果。

基于E165R基因非洲猪瘟LAMP快速检测方法的建立

【目的】建立特异性好、灵敏度高的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)快速检测方法,为非洲猪瘟的实时实地快速检测提供参考。【方法】通过对非洲猪瘟病毒多种基因型66个毒株的E165R基因多序列比对,选取相对保守区域设计LAMP引物,并对反应条件及反应体系进行优化。在获得的最优反应条件及体系下考察方法的检测特异性和灵敏性。【结果】选取的LAMP检测靶标235 bp(29~264 bp)在不同基因型ASFV毒株中保守性较好,序列相似度达94.46%~100%;LAMP反应的最佳温度为64℃、时间为35 min、Mg 2+浓度为8 mmol/L、内外引物比为8︰1、Bst DNA聚合酶量为16 U。建立的ASFV环介导等温扩增检测方法最低检测限为50 copies/μL,较常规PCR检测提高1个数量级,且35 min即可完成扩增反应。LAMP检测方法与猪圆环病毒2型(PCV2)、伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸道综合症病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)4种临床症状类似的猪病毒感染性疫病没有交叉反应。【结论】基于该新检测靶点的ASFV LAMP检测具有良好的特异性,可成功区分与ASFV感染临床症状相似的猪感染性疾病,且灵敏度优于常规PCR检测方法,方法简单、检测成本低,可实现ASFV的特异、灵敏、快速检测。

人VEGF_(165)基因在狗骨髓基质细胞中的表达

目的 :检测转染 pcDNA3 hVEGF165狗骨髓基质细胞的VEGF165mRNA表达。方法 :用脂质体介导转染狗骨髓基质细胞 ,用免疫组化及RT PCR检测VEGFmRNA的表达。结果 :重组质粒 pcDNA3 hVEGF165转染骨髓基质细胞后 ,免疫组化及RT PCR检测有VEGFmRNA的表达。结论

MMP-2与VEGF_(165)基因mRNA在卵巢癌中表达及相关性研究

目的:探讨MMP-2和VEGF165基因mRNA表达在卵巢癌发生和演进中的作用。方法:利用RT-PCR方法检测正常卵巢(n=5)、卵巢囊肿(n=5)、卵巢交界性肿瘤(n=9)和上皮性卵巢癌(n=60)中MMP-2和VEGF165基因mRNA表达。结果:MMP-2和VEGF165基因mRNA在卵巢交界性肿瘤和卵巢癌中的表达水平高于正常卵巢和卵巢囊肿(P<0.05),与卵巢癌的临床病理分期呈正相关(P<0.05),而与组织分化程度呈负相关(P<0.05);浆液性卵巢癌中MMP-2和VEGF165基因mRNA表达水平显著高于其他上皮性卵巢癌(P<0.05)。结论:在卵巢癌中MMP-2和VEGF165基因mRNA表达上调,与卵巢癌的发生和病理生物学行为关系密切;MMP-2和VEGF165基因mRNA表达上调参与了卵巢癌的发生,提高了卵巢癌的侵袭转移能力,因此,构成了卵巢癌发生和侵袭的分子基础。

直接心肌植入VEGF_(165)基因的实验研究

目的 :评估VEGF1 6 5基因直接心肌内注射促进心肌血运重建的疗效。方法 :中国实验小型猪 11只 ,体重 (2 9 3± 4 3)kg。在左冠状动脉回旋支 (LCX)近心端放置Ameroid收缩环。术后 6周行冠脉造影示LCX狭窄 >95 %为慢性心肌缺血模型形成。将选用模型随机分为治疗组 (n =6 )和对照组 (n =5 )。治疗组将VEGF1 6 5质粒注射到左室侧壁 10处有标记的心肌中层。对照组只注射空白质粒。治疗前和治疗 6周后 ,采用体表超声心动图观察静息与小剂量多巴酚丁胺负荷 (LDDSE)状态下左心室壁运动及功能 (LVEF、RT、MVCF、WMSI) ,通过2 0 1 TI SPECT观察心肌灌注改变。处死动物后进行心肌血管密度和VEGF基因mRNA表达测定。结果 :治疗 6周后 ,在静息与LDDSE(10 μg min kg)状态下 ,A组RT和WMSI较治疗前显著改善 ,侧壁灌注缺损明显缩小 ,B组改善不明显。A组每个视野的血管面积、血管周长及血管数目均较B组多。A组 2 3例局部心肌VEGF基因mRNA的表达明显 ,B组 3 3例均无表达。结论 :直接心肌内注射VEGF1 6 5基因可促进慢性缺血心肌的血管再生 ,改善局部心肌灌注和室壁运动。

小麦热胁迫响应基因TaMYB165的克隆与功能分析

【目的】MYB转录因子在植物生长发育和抗逆过程中起着重要作用,克隆小麦MYB基因并对其功能进行研究,对植物MYB转录因子的调控机制具有重要意义。【方法】利用Affymetrix小麦芯片系统,分析2个小麦品种中国春(热敏感)和TAM107(耐热)在不同热胁迫处理下的转录谱,从热胁迫上调表达的EST序列中克隆得到小麦耐热相关TaMYB165基因,并对该基因的表达特性及功能进行研究;利用实时定量RT-PCR技术分析小麦不同发育时期、不同组织器官热胁迫处理下TaMYB165基因的动态表达模式,构建超表达载体并转化拟南芥,对获得的转基因拟南芥株系进行耐热性鉴定。【结果】克隆获得1个小麦MYB转录因子家族基因TaMYB165,该基因ORF长度为847 bp,编码282个氨基酸。同源序列分析表明,TaMYB165与高粱SORBIDRAFT 03g040120亲缘关系最近(73.2%),与水稻MYB蛋白和拟南芥AtMYB165的相似性分别为70.37%和33.0%。qRT-PCR结果显示,TaMYB165在小麦苗期和灌浆期都受热胁迫诱导表达,只是响应的早晚有所不同。在拟南芥中过量表达TaMYB165,转基因株系热胁迫后成活率提高,细胞膜热稳定性增强。【结论】TaMYB165是小麦热胁迫响应的重要转录因子,可作为小麦耐热育种的重要候选基因。

hBcl-2和hVEGF_(165)双基因重组腺病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的将hBcl-2和hVEGF165双基因共表达重组腺病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),检测目的基因的表达及表达产物的生物学效应。方法贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞;重组腺病毒转染BMSCs,用PCR法验证目的基因mRNA在间充质干细胞中的表达;用ELISA及Western Blot检测双基因在转染后细胞的蛋白表达量;用MTT法及Annexin V-PE/7-AAD法分别观察对转染后BMSCs增殖及凋亡的影响。结果大鼠BMSCs分离纯化成功。在mRNA水平,转染后的BMSCs可表达这两个外源基因;转染后细胞培养上清液hVEGF165峰浓度达到(924.3±56.5)pg/mL,多个时间点与对照组相比,浓度差异有统计学意义(P<0.05);Western Blot也检测到转染后细胞Bcl-2蛋白表达量明显比对照组增加(P<0.05)。MTT比色法观察到,转染细胞分泌的hVEGF165上清液可促进BMSCs的增殖(P<0.05);用Annexin V-PE/7-AAD检测转染后间充质干细胞的凋亡率下降,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论转染重组腺病毒载体的BMSCs能够表达hBcl-2及hVEGF165,并且表达产物具有生物学效应。

hBcl-2和hVEGF_(165)双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建hBcl-2和hVEGF165双基因共表达的重组腺病毒载体,为后续基因转染和动物实验提供实验基础。方法通过RT-PCR从A549细胞中分别获得hBcl-2和hVEGF165基因片段,并克隆到pMD-19T载体。将目的基因hBcl-2、IRES元件和hVEGF165依次定向克隆到腺病毒穿梭载体质粒pAd-Track-CMV上。线性化重组穿梭质粒后通过电穿孔转化含有腺病毒骨架质粒pAd-easy-1的感受态大肠杆菌BJ5183构建重组腺病毒载体质粒。脂质体转染线性化的重组腺病毒载体质粒于HEK293细胞以包装制备重组腺病毒。重组腺病毒经PCR鉴定之后进一步扩增、纯化。通过荧光计数确定病毒感染滴度。结果克隆的hBcl-2和hVEGF165基因测序正确,酶切重组穿梭载体质粒和腺病毒载体质粒得到特异酶切产物,重组腺病毒载体质粒转染HEK293细胞3 d后观察到GFP的表达,重组腺病毒的PCR得到hBcl-2和hVEGF165基因的PCR产物,滴度测定为5×109pfu/mL。结论成功构建制备了高滴度的hBcl-2和hVEGF165双基因共表达的重组腺病毒载体,为联合基因治疗心肌梗死的研究提供实验基础。

支架携带pSV-VEGF_(165)基因促进内皮修复的实验研究

目的评估通过支架向兔颈动脉壁转染pSV -VEGF165基因促进内皮修复的疗效。 方法采用自制支架导送系统 ,由生物凝胶介导 ,将携带质粒 pSV -VEGF165的支架植入兔一侧颈动脉段 ,对侧植入携带质粒 pSV - β- gal的支架作对照。通过RT -PCR、免疫组化染色及扫描电镜 ,观察局部动脉壁外源VEGF基因、蛋白的表达及内皮修复情况。 结果RT -PCR检测证实 ,支架植入术后 1d ,VEGF基因转染动脉段有VEGFmRNA的表达 ;7d表达达高峰。免疫组化染色显示 ,术后 3d外源VEGF蛋白表达 ,表达时间延迟于基因表达 ,但表达趋势与基因表达一致。扫描电镜显示 ,治疗组内皮完全修复时间提前至术后 1月。 结论采用支架携带基因的方法能成功将 pSV -VEGF165基因转移至血管壁 ,血管壁细胞能摄取基因 ,并表达具有生物学功能的蛋白质 ,促进内皮修复。

种植转染VEGF_(165)基因骨髓基质细胞的脱蛋白异体骨在裸鼠体内的成骨

目的:探讨脱蛋白骨支架种植转染血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)165基因的骨髓基质细胞体内的成骨作用。方法:从狗的髂骨穿刺骨髓分离骨髓基质细胞,应用脂质体转染VEGF165基因,以RTPCR检测转染的基因表达。随机选取4周龄BALB/C裸鼠30只,随机分为3组,各组10只。实验组A为脱蛋白骨+转染pcDNA3hVEGF165基因的骨髓基质细胞;实验组B为脱蛋白骨+骨髓基质细胞;对照组C为单纯植入脱蛋白骨+DMEM。在脊柱两侧分开肌间隙,每只裸鼠植入2块脱蛋白骨材料至肌腹内。术后4、8周处死取材,经大体观察、组织形态学与免疫组化方法检查细胞-材料复合物植入后的成骨作用及VEGF表达。结果:组织学检查A、B组均有成骨,并随时间延长而新骨增多,但其中转基因的A组其成骨作用明显,并在植入4周后免疫组化可见VEGF表达呈阳性;对照组C无成骨现象。结论:转染VEGF165基因骨髓基质细胞复合脱蛋白骨在体内具有较好的成骨作用。

携tPA和VEGF165基因共表达质粒生物学功能研究

目的 观察组织纤溶酶原激活物(tPA)和血管内皮生长因子16 5 (VEGF16 5 )基因在血管内皮细胞(VEC)中的表达产物对VEC增殖和纤溶的影响。方法 将含有tPA和VEGF16 5的共表达质粒pBudCE4 1/tPA VEGF16 5导入VEC中,RT PCR法和Westernblot法分别从mRNA水平和蛋白质水平检测被转染VEC中的tPA和VEGF16 5表达;纤溶蛋白板法检测转基因VEC培养液的纤溶活性;用3 H胸腺嘧啶核苷掺入法( 3 H TdR)和流式细胞技术观察转基因VEC培养液对VEC和VSMC增殖的影响。结果 pBudCE4 1/tPA VEGF16 5转染VEC后,tPA和VEGF16 5分别在mRNA和蛋白质水平均有表达;转基因培养液有纤溶活性,并对VEC增殖有显著作用,而对VSMC增殖无作用。结论 pBudCE4 1/tPA VEGF16 5能在VEC表达出有生物学活性的tPA和VEGF16 5。

VEGF-165/ANG-1双基因共转染血管内皮祖细胞复合多孔生物活性玻璃的生物相容性研究

目的制备一种具有诱导血管再生活性的新型复合骨组织工程材料,并评价其生物相容性。方法将血管内皮生长因子-165(VEGF-165)/血管生成素-1(ANG-1)双基因共转染的血管内皮祖细胞(EPCs)复合多孔生物活性玻璃,制成复合人工骨材料。采用Western blot、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测已转染EPCs中VEGF-165及ANG-1的表达。噻唑蓝(MTT)细胞毒性试验、骨植入试验及扫描电镜观察细胞在材料表面黏附情况等综合评价材料的生物相容性;CD31免疫组织化学法染色观察材料中血管再生的情况。结果Western blot检测、RT-PCR反应显示,实验组VEGF-165、ANG-1的表达较对照组升高。MTT细胞毒性试验、骨植入试验均显示,材料无毒性反应。扫描电镜显示,材料表面有较多血管内皮祖细胞黏附,并有较多伪足伸出。苏木精-伊红染色法(HE)染色显示,材料周围组织生长良好,未见明显的炎症细胞浸润,材料与周围组织交界处有大量的新骨生成。CD31免疫组织化学法染色显示,材料中有较多新生的毛细血管。结论 VEGF-165/ANG-1双基因共转染EPCs复合多孔生物活性玻璃的骨组织工程材料生物相容性良好,具备一定的诱导血管再生活性。

稳定表达人VEGF165的NIH/3T3细胞株的筛选与鉴定

目的培养NIH/3T3细胞,并进行慢病毒载体介导的VEGF165基因转染,为建立转基因小鼠血管瘤模型奠定基础。方法采取贴壁培养法分离培养NIH/3T3细胞,细胞随机分为3组,分别为Lenti-VEGF165-EGFP重组慢病毒载体转染组、Lenti-EGFP慢病毒转染组和未转染组,转染后72h荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白的表达,流式细胞仪分选后用ELISA方法检测VEGF165外分泌。结果 ELISA检测转染后小鼠NIH/3T3细胞,Lenti-VEGF165-EGFP重组慢病毒载体感染组、Lenti-EGFP慢病毒转染组和未转染组培养上清中VEGF165浓度分别为(205±15)、0、0ng/L(P<0.05) 结论 NIH/3T3细胞获得慢病毒载体介导的VEGF165表达基因修饰且稳定传代,为下一步血管瘤动物模型研究奠定了基础。

反义VEGF_(165)真核表达载体的构建和表达

目的 进行抗血管生成治疗人脑胶质瘤实验 ,构建和鉴定携带人反义 VEGF1 6 5 基因的真核表达载体 .方法 将VEGF1 6 5 c DNA反向克隆入 pc DNA3,构建 CMV启动子控制的真核表达载体 pc DNA- AVEGF1 6 5 ,用酶切鉴定结果 ;应用该载体转染人脑胶质瘤细胞 SHG44 ,G418筛选阳性克隆 ;Western blot和免疫组化检测转染前、后瘤细胞的 VEGF表达 .检测转染前、后瘤细胞的生物学性状 .结果 获得反向构建的 pc DNA- AVEGF1 6 5 真核表达载体 ,VEGF1 6 5 反义 RNA阻断了 SHG44细胞的 VEGF表达 ,该细胞生物学性状不受外源基因的表达影响 .结论 成功构建的反义 VEGF1 6 5 真核表达载体 。