结核分枝杆菌Rv3425-16kD融合蛋白原核表达及其刺激ATB患者IFN-γ释放水平研究

目的 原核系统表达与纯化结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis, MTB)融合蛋白抗原Rv3425-16kD,检测其能否被活动性结核病(active tuberculosis, ATB)中肺结核患者和结核潜伏性感染(latent TB infection, LTBI)者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)识别,探讨作为诊断抗原鉴别活动性结核感染的可行性。方法 利用原核表达系统表达融合蛋白Rv3425-16kD并进行亲和纯化,以Western Blot法鉴定;收集结核病医学部收治的的ATB患者、LTBI者和健康人外周血,分离PBMCs,分别用Rv3425-16kD融合蛋白、早期分泌靶抗原6/培养液蛋白10(ESAT-6/CFP10)和MTB全菌裂解液刺激后,提取细胞总RNA,荧光定量PCR方法检测γ-干扰素(Interferon-γ,INF-γ) mRNA的表达,通过t检验分析刺激前后PBMCs IFN-γ mRNA的表达差异。结果 原核系统表达及纯化的Rv3425-16kD融合蛋白相对分子质量均为37kD。健康人PBMCs刺激前,IFN-γ mRNA表达量为4.2±1.6,MTB全菌裂解液刺激后为14.7±3.5,差异具有统计学意义(P<0.001),另外两组刺激没有明显变化;ATB患者PBMCs刺激前,IFN-γ mRNA表达量为3.7±1.2,经Rv3425-16kD融合蛋白、ESAT-6/CFP10抗原多肽和H37Rv全菌裂解液分别刺激后IFN-γ mRNA表达量为:166.0±29.7、13.7±5.8和213.0±33.5,三组抗原在刺激前后IFN-γ mRNA表达量差异均具有统计学意义(P<0.001)。结论 原核重组的Rv3425-16kD融合蛋白可被ATB患者PBMCs细胞识别,具有较强抗原刺激作用和特异性,可用作MTB感染的预防及诊断。

重组结核分支杆菌38kD和16kD蛋白用于结核病血清学诊断的价值

目的 探讨国产重组结核分支杆菌蛋白 38kD(rTPA38)和 16kD(rTPA16)用于结核病的诊断价值。方法 以rTPA38和rTPA16为抗原 ,PPD为对照 ,用ELISA法检测血清中特异性抗结核抗体。结果 2 4 6例肺结核病组 ,rTPA38、rTPA16和PPD检测的灵敏度分别为 66.3%、63.0 %和 72 .3%。健康献血组、非结核呼吸疾病组和卡介苗接种阳转组血清同时用rTPA38、rTPA16和PPD检测 ,rTPA38特异性分别为 97.6%、96.8%、86.0 %。rTPA16特异性分别为 94 .7%、93.1%、75 .0 %。PPD特异性为93.4 %、85 .7%、67.9%。统计分析显示 ,rTPA38蛋白和PPD检测非结核呼吸疾病组 ,其阳性率有显著性差异 (P <0 .0 5 )。两者检测卡介苗接种阳转组阳性率和血清抗体滴度有显著性差异 (P <0 .0 5 )。rTPA38和rTPA16同时检测 10 8例肺结核病组血清可提高 11.1%的阳性率。结论 rTPA38蛋白抗原有较好的灵敏度和较高特异性 ,是ELISA的可靠抗原 ,与rTPA16联用可提高灵敏度 ,对结核病血清学诊断有较高参考价值。

结核分枝杆菌16kD-CFP10-19kD融合蛋白的构建表达及纯化

目的构建结核分枝杆菌(MTB)16k D-CFP10-19k D融合蛋白表达载体,在大肠杆菌中对蛋白进行表达并经过纯化获得16k D-CFP10-19k D融合蛋白。方法利用聚合酶链式反应(PCR)方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板扩增16k D、CFP10及19k D基因,经过限制性内切酶处理并依次与p ET28a载体连接,构建p ET28a-16k D-CFP10-19k D重组质粒,转化至大肠杆菌表达株BL21中,在IPTG及低温诱导下获得目标蛋白,镍柱层析获得纯化蛋白。结果经过酶切及测序鉴定验证p ET28a-16k D-CFP10-19k D重组质粒构建正确,原核表达获得可溶性目标蛋白并对其初步纯化。结论成功构建表达并纯化获得16k D-CFP10-19k D融合蛋白,为开发新的结核病特异性诊断抗原研究奠定基础。

结核分枝杆菌融合抗原38kD-Rv1419、16kD-Rv2041c在结核病血清学诊断中的应用价值

目的探讨结核分枝杆菌融合抗原38k D-Rv1419、16k D-Rv2041c在结核病血清学中的诊断价值。方法以痰涂片、痰培养和标准试剂盒作为对照,应用化学发光法(chemiluminescence immunoassay,CLEIA)检测结核病组、非结核呼吸系病组、健康对照组血清标本中38k D-Rv1419、16k D-Rv2041c的抗体水平,评价其在结核病血清学中的诊断价值。结果 1肺结核病组38k D-Rv1419、16k D-Rv2041c的抗体水平(143621.0±23231.7,179731.1±16342.1)明显高于非结核呼吸疾病组(27417.5±2371.8,32066.2±3310.9)和健康对照组(35262.9±5764.2,22765.5±3695.7),(P<0.05)。238k D-Rv1419、16k D-Rv2041c检测抗结核抗体的敏感度(69.0%,72.0%)、高于痰培养(21.0%)、38 k D(20.0%)、16 k D试剂盒(26.0%),(P<0.05)。338k D-Rv1419、16k D-Rv2041c检测抗结核抗体的特异度(85.4%,83.8%)高于38k D(61.1%)、16k D试剂盒(50.0%),(P<0.05)。4联合应用38k DRv1419、16k D-Rv2041c融合抗原检测抗结核抗体的敏感度为89.0%,明显高于38k D-Rv1419(69.0%)、16k DRv2041c(72.0%),(P<0.05)。结论结核分枝杆菌融合抗原38k D-Rv1419、16k D-Rv2041c在结核病的血清学诊断上均具有较高的敏感度和特异度,其联合应用,能够提高抗结核抗体检测的敏感度。

IgG抗体适体与16kD抗原联合检测血清结核抗体研究

目的研究结核患者IgG抗体适体与16 kD抗原组合在结核病血清学检测中的应用价值。方法 SELEX技术筛选得到结核患者IgG抗体适体,并将适体构建的混合ELISA体系用于少量血清标本的检测,初步鉴定适体的检测效果,然后将适体与16 kD抗原联合构建ELISA检测体系进行221份血清标本的分析。结果 SELEX筛选得到4个高亲和适体;单适体血清学检测结果显示,适体之间存在交叉互补性;适体两两组合检测效果显示,N1+N6组合的阳性平均值与阴性平均值的比值最高;221份血清标本检测结果显示,N1+N6适体组合、16 kD抗原以及N1+N6+16 kD组合3种检测体系的敏感性和特异性分别为47.31%和92.97%、49.46%和91.41%、51.61%和92.19%,N1+N6适体组合、16 kD抗原以及N1+N6+16 kD组合3种检测体系的结核病组和健康对照组之间的t检验结果依次为t=6.564,P<0.0001;t=5.279,P<0.0001;t=4.348,P<0.0001,结核病组和非结核疾病对照组之间的t检验结果依次为t=4.196,P<0.0001;t=3.014,P=0.0031;t=2.929,P=0.004,差异均具有统计学意义,三种检测方法之间卡方检验显示,差异无统计学意义(P>0.05);单独适体组合与单独抗原检测合并计算的敏感性、特异性为67.74%、84.38%,与N1+N6+16 kD组合检测结果的卡方检验显示,敏感性差异有统计学意义(χ2=8.52,P<0.05),特异性差异无统计学意义(χ2=2.04,P>0.05)。结论 SELEX技术筛选获得的特异性IgG抗体适体和16KD抗原联合具有良好的结核病血清学诊断价值,可用于结核病的实验室诊断。

结核杆菌重组基因16kD-38kD融合蛋白诊断结核病的应用价值

目的:构建结核杆菌16kD-38kD重组融合基因,纯化16kD-38kD融合抗原,进一步评价其在结核病血清学诊断中的应用价值。方法:通过构建重组结核杆菌16kD-38kD融合基因工程菌株,经亲和层析纯化融合蛋白,以此蛋白为抗原,建立金标免疫层析法检测结核病人血清中的特异性抗体,同时与单一的16kD重组蛋白和18kD重组蛋白进行比较。结果:16kD、38kD、16kD-38kD三种重组抗原检测肺结核病人血清201份检出率分别56.2%(113/201)、57.7%(116/201)、73.6%(148/201),融合蛋白抗原阳性检出率明显高于单一重组蛋白抗原,对菌阳血清的检出率达到81.9%;检测健康体检血清179份阴性符合率分别为87.2%(156/179)、89.9%(161/179)、88.8%(159/179),三种蛋白无明显差异。结论:16kD-38kD融合蛋白具有较好的敏感性和特异性,与单一使用两种蛋白比较,对结核病人血清抗体的检出率有很大的提高,在结核病血清学诊断中有较高的参考价值。

携带16 kD抗原多肽的PP7噬菌体样颗粒的制备及其对结核病诊断的价值评估

目的获得表面展示有16kD抗原多肽(16kD91-110)的PP7噬菌体样颗粒(bacteriophage-like particle,BLPs),并评价其在结核病诊断中的价值。方法用普通PCR技术扩增出含16kD91-110多肽编码基因的PP7衣壳蛋白基因,将其插入到pETDuet-2PP7载体中,获得pETDuet-2PP7-16kD91-110质粒;将上述重组质粒转化大肠埃希菌,诱导表达产物用SDS-PAGE和western blot进行鉴定;将纯化的2PP7-16kD91-110作为刺激抗原,用ELISA间接法检测结核病患者血清中的16kD抗体水平。结果SDS-PAGE及电镜结果显示成功表达2PP7-16kD91-110BLPs,并且展示于PP7 BLPs表面的16kD91-110多肽表位能特异性与抗16kD抗体结合;对活动性肺结核和潜伏性肺结核患者,以2PP7-16kD91-110BLPs为刺激抗原的全血释放γ干扰素试验的敏感性分别为75%和82.9%,与北京万泰结核分枝杆菌相关γ干扰素释放试剂盒相比,差异无统计学意义。结论成功制备表面展示有16kD91-110多肽的PP7 BLPs,为应用γ干扰素释放试验检测结核分枝杆菌提供了一种安全性高、稳定性好、价格低廉的刺激抗原,为结核病的诊断提供一种新的思路。

小毛莨内酯对结核休眠菌感染病人GLS mRNA表达的影响

目的 研究小毛莨内酯抗人体结核休眠菌感染的分子免疫学机理。方法 采用PCR方法检测结核病人PBLs中结核菌 16kDα 晶状体同源蛋白DNA阳性的 5 6例患者为本研究对象 ;采用反转录聚合酶链反应半定量 (QC RT PCR)方法 ,测定不同剂量的Tern .对以上病人PBL颗粒裂解肽mRNA表达水平的影响。结果 当Tern .在 10 0mg L ,2 0 0mg L浓度时 ,能诱导结核休眠菌感染病人体外活化的PBLGLSmRNA的表达。结论 Tern .可能通过促进颗粒裂解肽mRNA的表达 ,增强机体CTL杀菌能力 ,达到抗结核休眠菌的作用。

结核生物蛋白芯片在结核病早期诊断中的应用

目的通过分析结核分枝杆菌LAM、16KD、38KD抗原的IgG抗体说明其检出率和早期诊断意义。方法对2013年1月至2013年5月来白城市传染病医院门诊和住院的就诊229例患者分别应用蛋白芯片法进行定性检测,随机抽取其中96例阳性者进行痰涂片抗酸染色法定性检测。结果在229例血清检测标本中,结核抗体阴性标本者114例,结核抗体阳性者115例,检出的阳性率为50.22%。随机选择96例蛋白芯片法检测阳性者做痰涂片抗酸染色法定性检测,痰涂片阳性者仅为17例,阳性率仅为17.71%。结论作者认为采用生物蛋白芯片技术联合检测3种结核抗体,可提高其诊断结核病的敏感性和特异性,并作为结核病的血清学早期诊断方法之一。