水稻叶绿体16S启动子克隆改造、载体构建及转化研究

利用PCR方法从水稻叶绿体基因组DNA中分离 1 6S启动子 ,并在其下游加入rbcL基因SD序列 ,以增强该启动子的翻译能力 ;序列分析表明 ,除加入的SD序列外 ,扩增片段与水稻 (Oryzasativa)叶绿体基因组DNA序列 1 6S启动子相应区域同源性为 1 0 0 %。将 1 6S启动子与bar基因和gfp基因的融合基因连接 ,以psbA基因的 3′序列为终止子 ,并以烟草叶绿体trnH_psbA和trnK为同源片段构建了烟草叶绿体表达载体pR1 6S。用基因枪转化烟草 ,转化植株经Southern、Northern检测及后代遗传学分析 ,发现1 6S启动子具有启动活性 。

烟草叶绿体16S启动子的克隆改造及转基因植株的获得

设计引物并克隆了烟草叶绿体16SrDNA基因的启动子,并在其下游加入了rbcL基因的SD序列,以使该启动子能有效翻译外源基因;进一步以aadA基因作为外源基因,以psbA基因的3’序列为终止子,构建成aadA基因表达盒;将此表达盒插入烟草叶绿体同源片段trnK-psbA-trnH中,构建成烟草叶绿体转化及表达载体P16T.用基因枪微弹轰击转化法,将该载体导人野生型大烟草叶绿体中,建立了烟草叶绿体遗传转化体系,转化频率为0.5株/枪.对转化植株进行PCR及遗传杂交实验分析,证明外源基因已在烟草叶绿体中稳定整合并遵循母系遗传规律.