应用16S rDNA扩增子序列分析去卵巢骨丢失小鼠口腔菌群的变化

背景口腔微生物失调加重了多种口腔疾病和系统性疾病的进程。进入绝经后期的妇女罹患口腔黏膜病和加速牙周骨质丢失的风险更高,但口腔菌群变化与女性进入绝经后期之间的联系尚不清楚。目的应用16S rDNA扩增子测序,初步观察卵巢切除小鼠的口腔菌群结构变化。方法16只雌性C57BL/6J小鼠随机分为卵巢切除(ovariectomy,OVX)组和假手术(sham-operated,Sham)组。卵巢切除术4周后对股骨进行显微CT扫描和骨密度与骨参数的分析,取小鼠口腔拭子进行16S rDNA高通量测序。结果与Sham组比较,OVX组骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度和骨小梁数量显著下降,骨表面积/骨体积和骨小梁分离度显著升高(P<0.05)。两组的口腔菌群共同含有687种ASVs,Sham组特有1086种,OVX特有930种。OVX组的Chao1指数与Sham组差异无统计学意义,但Simpson指数显著低于Sham组(P<0.05)。门水平上OVX组的拟杆菌门和梭杆菌门丰度较Sham组下降(P<0.05)。属水平上OVX组的梭杆菌属、乳酸乳球菌属、萨特氏菌属等菌属的丰度相比SHAM组降低(P<0.05);放线菌属等菌属的丰度相比Sham组升高(P<0.05)。LEfSe分析结果显示,Sham组厚壁菌门和芽孢杆菌纲(Bacilli)的相对丰度升高(P<0.05)。结论卵巢切除小鼠出现骨丢失现象,并且口腔菌群的多样性和菌群结构发生了改变,初步为研究绝经后妇女口腔菌群改变与口腔疾病加重的关系提供依据。

基于16S rRNA和gyrB基因串联DNA特征序列的气单胞菌鉴定方法

【目的】建立基于16S rRNA序列和gyrB基因串联DNA特征序列的属内菌种鉴定方法,为气单胞菌的种间区分提供技术支持。【方法】以2020—2021年在我国福建、江苏等地分离获得的水产源气单胞菌和NCBI已公布且完成全基因组测序的10种气单胞菌为研究对象,分别以16S rRNA序列、gyrB基因及2个基因序列串联后得到的新DNA特征序列作为构建系统发育进化树的依据,比较不同系统发育进化树的鉴定结果,并以运动性试验、溶血性试验、糖发酵试验进行辅助鉴定。【结果】在基于16S rRNA序列构建的系统发育进化树中,中间气单胞菌、嗜水气单胞菌、达卡气单胞菌、肠源气单胞菌等聚类在不同分支上,未能形成独立的种属进化分支;在基于gyrB基因构建的系统发育进化树中,达卡气单胞菌、豚鼠气单胞菌和嗜水气单胞菌聚类在同一分支上,而异嗜糖气单胞菌和维氏气单胞菌聚类在另一分支上。将16S rRNA序列和gyrB基因串联组成新DNA特征序列再构建系统发育进化树建树,能完全有效分离气单胞菌属的不同菌株,将不同种的气单胞菌独立聚为一支,较好地实现种间区分。【结论】将16S rRNA序列和gyrB基因串联组成新DNA特征序列再构建系统发育进化树,较基于16S rRNA序列或gyrB基因单独构建系统发育进化树具有更高的分辨力,是一种理想的保守序列相似性高的属内菌种鉴定方法。因此,在16S rRNA测序鉴定为气单胞菌的情况下可再次以gyrB基因为测序对象,获得序列信息后与16S rRNA序列串联构建系统发育进化树,能更加精确地将气单胞菌鉴定到种水平。

16S rRNA基因序列用于临床非典型细菌的补充鉴定

目的利用16SrRNA基因序列分析方法鉴定临床非典型细菌,为临床细菌分类鉴定新方法提供补充。方法提取细菌的DNA,自行设计引物并利用PCR技术扩增细菌16SrRNA基因片段,并对扩增片段进行序列测定,利用Blast等在线软件进行序列同源性分析。结果在32株临床非典型细菌中,3株细菌可以鉴定到“属”,29株细菌可以鉴定到“种”,其中2株可以鉴定到“亚种”。结论16SrRNA基因序列分析法是有效的病原细菌分类鉴定的补充。

马源肠道芽孢杆菌的16S rDNA序列测定及系统进化分析

研究旨在对马源肠道芽孢杆菌进行16S rDNA测序和系统进化分析。采集5匹成年马的新鲜粪便,经划线分离、纯化镜检、生化鉴定后获得5株菌,分别命名为QM、BM、Y1M、Y2M、Z2M,采用16S rDNA扩增通用引物,进行序列测定,测序结果与GenBank DNA数据库的序列比对,并构建进化树。结果显示:QM、BM、Y1M均为蜡样芽孢杆菌,Y2M为解淀粉芽孢杆菌,Z2M为赖氨酸芽孢杆菌。研究表明,马肠道内含有丰富的芽孢杆菌,可为马源益生菌提供天然菌种,促进马属动物肠道健康。

3个木薯品种的叶绿体基因组16S rRNA-23S rRNA基因间隔序列的特征分析

以华南6、8、10号木薯为材料,通过PCR克隆3个木薯品种的叶绿体16S-23S基因间隔序列,与其他17种植物的该序列进行亲缘关系分析。从进化树可以看出,该序列进化分析符合Webster分类系统,同科植物可以很好的聚为1类。此外,3个木薯品种的16S-23S基因间隔序列相似性高达99.94%;大戟科间的序列相似性为97.52%;其他植物科内的序列相似性不低于96%。该研究还分析了3个木薯品种16S-23S基因间隔序列的基因分布,该序列的基因分布情况一致,包含16S rRNA 5′端,trnI基因,ycf68基因,trnA基因,23SrRNA3′端,ISR-B,发现该序列的保守性较强,个别碱基差异并不影响基因分布,该研究可为后期木薯叶绿体遗传转化体系建立提供理论依据。

基于16S rDNA序列、MALDI-TOF-MS和VITEK的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的鉴定

沙门氏菌和金黄色葡萄球菌广泛存在于食品及环境中,对食品安全造成一定的威胁。在食源性致病菌检测过程中,选择合适的方法不仅可以缩短时间,节省人力物力,还能更好地溯源。选取210株沙门氏菌和18株金黄色葡萄球菌,使用16S rDNA序列测定、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和VITEK全自动细菌鉴定系统对其鉴定,使用R软件包(v3.6.1)对鉴定结果进行统计和相关性分析,比较3种方法的鉴定水平和效率。结果表明:3种方法均可将210株沙门氏菌(100.0%)鉴定到属水平;16S rDNA序列测定方法可将18株(100.0%)金黄色葡萄球菌鉴定到属水平,可将其中15株(83.3%)菌鉴定到种水平;MALDI-TOF-MS和VITEK可将18株金黄色葡萄球菌(100.0%)鉴定到种水平。除16S rDNA序列测定方法外,其余2种方法对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的鉴定水平相同,而MALDI-TOF-MS鉴定所需时间最短、效率最高。

16S rDNA序列分析法在注射剂微生物污染鉴定及溯源分析中的应用

目的对一次注射剂无菌检查阳性结果进行溯源。方法采用16S rDNA序列分析法对污染菌A1和污染调查中采集的16株葡萄球菌进行鉴定和同源性分析,并将分析结果用脉冲场凝胶电泳进行验证。结果A1的鉴定结果为科氏葡萄球菌;科氏葡萄球菌科氏亚种菌株的核糖体16S亚基序列完全相同;结合PFGE分析显示A1来自无菌检查使用的隔离器污染。结论制药企业可以使用16S rDNA序列分析法进行生产和检验中污染菌的鉴定和溯源,但对于与如科氏葡萄球菌科氏亚种一样核糖体16S亚基序列完全相同的菌株,需要结合其他同源性分析方法进行最终的判定。

三株优良促生菌的16S rDNA序列初探

百脉根根际分离出根瘤菌2株(LC15、LC20)与白三叶根际中分离出根瘤菌RW183基因组DNA经PCR扩增16S rDNA序列、阳性克隆检测、质粒提取测序,并与GenBank中已知序列比对,结果表明,菌株LC15与LC20的16S rDNA序列与多株克雷氏菌属(Klebsiella sp.)的16S rDNA核苷酸序列的同源性均超过99.00%,RW18与勒克氏菌属中的Leclercia adecarboxylata (HQ242722)核苷酸序列同源性为99.79%,结合各菌株的主要生理生化特征,将菌株LC15与LC20初步鉴定为Klebsiella sp.,将菌株RW18鉴定为Leclercia sp.。

基于16S rRNA序列分析的动物饮片典型菌污染特征研究

目的:探讨以动物组织为药用部位的饮片微生物污染模式及典型菌污染特点。方法:收集16味46批常见动物类饮片,依据2020年版《中华人民共和国药典》规定方法,对样品进行需氧菌总数(TAMC)、酵母霉菌总数(TYMC)、耐热菌及规定控制菌检验;采用多因素线性回归分析方法探究与样品微生物污染载量相关的因素;运用16S rRNA序列分析方法鉴定饮片污染典型菌。结果:37.0%的样品TAMC超过10^(4)CFU·g^(-1),32.6%的样品TYMC超过10^(3)CFU·g^(-1),60.9%的样品可检出耐热菌;不含内脏组织动物饮片lg TYMC均值高于含内脏组织饮片(P=0.01),其TYMC检出不合格率高于含内脏组织组(χ^(2)=7.59,P=0.00);采收加工炮制过程中未经热处理样品lg TYMC均值高于热处理组(P=0.02),TYMC检出不合格率高于热处理组(χ^(2)=3.99,P=0.04)。13.0%(6/46)的样品检出耐胆盐革兰阴性菌,8.7%(4/46)的样品耐胆盐革兰阴性菌载量超过10^(4)MPN·g^(-1),8.7%(4/46)样品中检出大肠埃希菌,1批蝉蜕样品中检测到铜绿假单胞菌。样品TAMC载量与耐热菌载量呈相关性(P=0.00)。样品中共分离到55株典型菌,芽胞杆菌属细菌占47.3%,肠杆菌属细菌占23.6%,肠球菌占16.4%,样品中检出蜡样芽胞杆菌、阴沟肠杆菌复合体成员等条件致病菌。结论:含动物组织类饮片微生物负载水平高,耐热菌污染严重,耐胆盐革兰阴性菌污染率低,需氧菌负载与耐热菌负载水平具有相关性,饮片典型菌以芽胞杆菌属细菌污染最常见,但污染频率高的条件致病菌在动物饮片微生物控制中应引起足够重视。

河北省5株牛支原体的分离鉴定和药敏试验

为了确定肉牛场犊牛患呼吸道疾病死亡的致病原,本试验采集河北省秦皇岛地区5个肉牛养殖场病牛的肺脏组织进行病原的分离培养,采用染色镜检、培养特性观察、支原体特异性oppD/F基因鉴定、16S rRNA序列比对和同源性分析鉴定分离菌株,并通过药敏试验筛选敏感药物,检测中西药对分离菌株的抑菌效果。结果显示,分离菌株在PPLO肉汤固体基础培养基上为针尖大小白色菌落,瑞氏染色菌体呈球状;oppD/F基因和16S rRNA基因扩增均可得预期目的条带,16S rRNA基因序列与NCBI中牛支原体参考序列同源性达99%,在遗传进化树中处于同一分支,共从病牛肺脏分离鉴定出5株牛支原体,分别命名为ZYT-1~ZYT-5;药敏试验结果显示,5株牛支原体分离菌株对恩诺沙星、环丙沙星、土霉素和氟苯尼考极度敏感,对中药苏木、五味子、白头翁和乌梅极度敏感。结果表明,肉牛场患病犊牛的致病原为牛支原体,本试验结果可为当地牛支原体感染临床病例的治疗用药提供参考依据。

氨磷汀通过调节肠道菌群对急性辐射损伤的防护作用机制

目的探究氨磷汀对急性辐射损伤小鼠的防护作用机制。方法30只C57BL/6J小鼠随机分成正常对照组、模型组和氨磷汀组(150 mg/kg),每组10只。照射前30 min氨磷汀组小鼠腹腔注射氨磷汀,正常对照组和模型组小鼠腹腔注射等体积生理盐水,然后模型组和氨磷汀组小鼠予4 Gy X射线一次性全身照射致急性辐射损伤。检测照射前2 h和照射后第1、4、7、10、14天小鼠外周血中白细胞、血小板和红细胞计数,分析照射后第7天各类白细胞(中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞)的比例变化;采用16S rRNA扩增子测序技术分析照射后第7天小鼠粪便中肠道菌群结构,并与各类白细胞进行相关性分析。结果氨磷汀组小鼠白细胞计数在照射后第1、4、7、10天,血小板计数在照射后第10天,红细胞计数在照射后第1天均显著高于模型组(P<0.05)。与正常对照组比较,模型组小鼠肠道菌群β多样性发生改变,厚壁菌门相对丰度升高,拟杆菌门相对丰度降低;氨磷汀逆转了上述肠道菌群β多样性以及拟杆菌门和厚壁菌门相对丰度的变化。模型组有异芽孢杆菌属、丹毒丝菌纲、丹毒丝菌目和丹毒丝菌科4个差异性物种,其丰度与外周血淋巴细胞比例呈显著负相关(P<0.01),氨磷汀组有小鼠乳杆菌和卷曲乳杆菌2个差异性物种,其丰度与中性粒细胞比例呈显著负相关(P<0.05)。结论氨磷汀可通过维持肠道微生物菌群平衡来减轻辐射造成的急性损伤。

人工养殖对尼罗罗非鱼肠道菌群的影响

试验旨在研究人工养殖对尼罗罗非鱼肠道菌群的影响。研究采用16S rDNA测序方法对野生(YS)和人工养殖(YZ)尼罗罗非鱼的肠道内容物进行测序,分析比较两者肠道菌群生物丰富度及多样性差异。结果表明,在野生环境下,尼罗罗非鱼肠道中Actinobacteriota、Proteobacteria和Firmicutes为主要优势菌群;在人工养殖环境下,Actinobacteriota、Proteobacteria和Cyanobacteria为主要优势菌群。肠道菌群多样性的分析表明,YZ组群落多样性指数低于YS组(P<0.05)。门水平上,YZ组的Proteobacteria、Acidobacteriota、Bacteroidota和NB1-j菌门低于YS组(P<0.01或P<0.05),Cyanobacteria、Dependentiae高于YS组(P<0.01或P<0.05)。属水平上,YZ组的norank_f_norank_o_Chloroplast、 Mycobacterium、 Paeniclostridium、 IMCC26207、 Methylocystis和Conexibacter菌属高于YS组(P<0.01),Exiguobacterium、norank_f_Steroidobacteraceae、norank_f_SC-I-84菌属低于YS组(P<0.01)。Spearman相关分析结果表明,在门分类水平上,环境因子对不同分组样本中物种数据分布的影响排序为pH值>NH_(4)-N>NO_(2)-N>O>PO_(4)-P。在属分类水平上,环境因子对不同分组样本中物种数据分布的影响程度排序为NO_(2)-N>NH_(4)-N>pH值>O>PO_(4)-P。研究表明,人工养殖会改变尼罗罗非鱼的肠道菌群,有助于解释肠道菌群对养殖和野生环境下尼罗罗非鱼健康和生长的影响。

3种方法对1株临床疑难菌的鉴定及结果比较

目的通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)、16S rRNA序列分析和全基因组测序(WGS)对从临床标本中分离的1株疑似盐单胞菌进行菌种鉴定,比较3种方法的鉴定结果。方法采用MALDI-TOF MS对待测菌进行蛋白质图谱收集,通过比对图谱特征峰实现菌种鉴定;对菌株进行16S rRNA基因测序,将测序结果与数据库比对;待测菌WGS后进行序列比对分析,具体包括使用ANIm和ANIb 2种方法计算平均核苷酸一致性(ANI)以及与基因组分类数据库(GTDB)进行比对;基于全基因组序列中的16S rRNA序列和看家基因序列构建系统进化树,以及基于COG和KEGG功能对基因组进行聚类分析。结果MALDI-TOF MS对待测菌株的鉴定结果是Halomonas hamiltonii;经16S rRNA序列分析,发现待测菌株与3种盐单胞菌(Halomonas hamiltonii、Halomonas stevensii和Halomonas johnsoniae)的相似度均>99%,且相似度差异非常小,因此无法进行准确的菌种鉴定;基于WGS的基因序列比对、系统发育树、聚类分析均显示待测菌与Halomonas stevensii的亲缘关系更为接近。结论3种方法对分离的1株疑难菌的菌种鉴定结果有差异,MALDI-TOF MS的菌种鉴定操作更加方便、快速,非常适用于临床检验工作;基于WGS的细菌鉴定更适合用于遗传特征相似的菌种之间的鉴别。

1株与创伤弧菌培养特性相似的哈氏弧菌的鉴定

目的对一株编号为sznj2009的菌株进行分析鉴定。方法从水产品中分离到菌株sznj2009,并对该菌株的菌落形态、生化特征及生物学特性进行分析鉴定。结果该菌株在弧菌显色平板上呈圆形、光滑、较小的无色菌落;在纤维二糖粘杆菌素(Cellobiose-Colistin,CC)琼脂平板和m CPC平板上为圆形、扁平,中心不透明但边缘透明的黄色菌落;在3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上为圆形、乳白色菌落。经16S rDNA序列分析发现,该菌株与哈氏弧菌(ATCC33843)的进化距离近、同源性高,相似度为100%。结论分离于水产品中的菌株sznj2009为哈氏弧菌。在创伤弧菌传统的生化鉴定检测工作中,通过比较,发现哈氏弧菌在菌落特征和生化特性上与创伤弧菌相似,但两菌株在弧菌显色平板和生化反应上可明显区分开来,可提高创伤弧菌的鉴定准确度,同时为哈氏弧菌传统分离鉴定检测工作提供参考和借鉴。

马腺疫链球菌新疆株2种新SeM基因型的鉴定及其遗传变异分析

为了解马腺疫链球菌新疆流行株的基因型、菌株的遗传多样性和系统发育特征,采集新疆地区某马场患病马匹下颌组织病样,分离马腺疫链球菌(Z422、JMC111),并对分离菌株进行生化特性和耐药特性检测,然后进行16S rRNA基因序列比较和SeM基因分子分型。结果显示,2株分离菌均为马链球菌马亚种,对头孢噻呋、头孢西丁、左氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、磺胺异恶唑敏感,对青霉素、头孢呋辛、氨苄西林、克拉霉素耐药。基于16S rRNA基因序列的分析显示2株菌均归属于Ⅰ群,基因分型鉴定为新的SeM基因型:seM 208和seM 209。

乳粉中发酵乳杆菌CECT5716微生物检测方法的建立

近年来乳粉中添加益生菌逐渐成为研究热点之一,为保证产品质量和安全,建立乳粉中发酵乳杆菌CECT5716的微生物检测方法。结果表明:在以缓冲蛋白胨水为稀释液进行10倍系列稀释后,采用MRS平板涂布法,(36±1)℃厌氧培养(48±2)h后,乳粉中发酵乳杆菌可准确计数,且能与乳粉中添加的双歧杆菌属细菌明显区分;该方法较GB 4789.35-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》方法更适合发酵乳杆菌计数,具有区分度高、培养时间短、操作简单、重复性好、准确性高的优点;该方法增加了菌株16S rDNA序列测定,以进一步对发酵乳杆菌进行分子鉴定;通过对20份自制样品进行检测评价,表明所建立的方法与国标方法的准确性无显著性差异(P=0.127)。

基于16S rDNA序列测序的川楝子肝毒性机制研究

目的 通过观察川楝子对大鼠肠道菌群的影响,初步探讨川楝子肝毒性机制。方法 以大鼠为研究对象,川楝子组灌胃川楝子溶液,连续给予21 d,末次给药后收集粪便样本,抽提粪便DNA,于Illumina MiSeq分析平台进行16S rDNA测序。结果 川楝子显著提高血清谷草转氨酶(aspartateaminotransferase,AST)、谷丙转氨酶(alanineaminotransferase,ALT)含量(P<0.05),降低总胆固醇(total cholesterol,CHO)、总蛋白(total protein,TP)含量(P<0.05)。菌群多样性分析和差异分析结果显示,川楝子降低大鼠肠道菌群多样性,可升高肠道厚壁菌门、放线菌门、杆菌、丹毒丝菌、乳杆菌属丰度;可显著降低梭菌、拟杆菌、瘤胃球菌属丰度。关联性分析显示,ALT和AST含量与双歧杆菌属、瘤胃球菌、粪球菌、脱硫弧菌、罗氏菌、梭菌、拟杆菌丰度显著相关;CHO、TP与普雷沃菌、密螺旋体、气球菌丰度显著相关。结论 川楝子能明显降低肠道菌群的多样性,其肝脏毒性机制可能与增加Allobaculum和丹毒丝菌的表达有关。

内蒙古地区传统发酵乳中乳酸菌的分离与鉴定

对内蒙古地区传统发酵乳中乳酸菌进行分离并鉴定。以蒙古族传统发酵乳为材料,采用传统的细菌纯培养分离方法分离乳酸菌株,通过形态学特征及生理生化试验初步确定乳酸菌的基础上,进一步利用细菌16S r DNA基因序列分析和系统发育进化树构建,对其种属进行分析鉴定。分析鉴定结果显示,分离得到的29株乳酸菌共鉴定为2个属,6个种。2个属分别为乳酸杆菌属(Lactobacillus)和肠球菌属(Entercoccus),6个种分别为短乳杆菌(Levilaccillus brevis,4株)、植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum,8株)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis,9株)、鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum,3株)、蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii,1株)、耐久肠球菌(Enterococcus durans,4株)。该研究采集的发酵乳样品中乳酸菌资源丰富,代表着内蒙古蒙古族传统发酵乳制品中优势性乳酸菌菌种,为优良发酵剂的研发奠定了微生物资源基础。

白术疫霉拮抗链霉菌的筛选、鉴定及其抑菌效果

本文从河北省安国市白术疫病发生地块的健康白术植株的根际土壤中,分离筛选对白术疫霉Phytophthora sansomeana有拮抗作用的链霉菌菌株,旨在为白术疫霉病害的绿色防控提供有效的生防资源。采用稀释涂布法和平板对峙法,分离、筛选得到3株对白术疫霉拮抗效果较好的链霉菌菌株BZX-23、BZX-31、BZX-104。经16S rDNA序列分析,结合菌落形态特征、生理生化特征,将这3株拮抗链霉菌菌株分别鉴定为加利利链霉菌Streptomyces galilaeus、包比链霉菌S.bobili、苜蓿链霉菌S.alfalfae,其对白术疫霉的抑制作用均在60%以上。

新疆地区母乳中乳酸菌的分离鉴定及潜在益生菌的筛选

母乳是婴儿营养物质的主要来源且蕴藏着丰富的乳酸菌资源。为了了解新疆地区母乳中乳酸菌组成,筛选母乳中具有优良益生特性的双歧杆菌。该文通过传统纯培养方法对6份新疆地区母乳中的乳酸菌进行分离鉴定。以益生菌株Bifidobacterium lactis BB12作为对照,通过发酵特性、体外胃肠液耐受性及胆盐耐受性试验对双歧杆菌进行筛选,得到2株具有潜在益生特性的双歧杆菌,对其进行最适pH,最适温度,对NaCl的耐受性,生长曲线及菌株产酸能力等生理生化特性试验。从6份样品中共分离到69株乳酸菌,鉴定为7个属11个种及亚种,其中Streptococcus salivarius为优势菌,通过初步筛选获得2株具有潜在益生特性的双歧杆菌:Bifidobacterium longum IMAU99727和Bifidobacterium animalis subsp.lactis IMAU99728,有望作为新的母乳源益生菌进行其他益生特性研究和开发利用。