16S核糖体DNA宏基因组测序中细菌核酸提取方法的比较研究

目的：探究细菌核酸提取方法对16S核糖体DNA（r DNA）宏基因组测序的影响。方法：分别采用TRIzol提取、试剂盒提取、溶葡酶＋试剂盒提取、超声波＋试剂盒提取、超声波＋溶葡酶＋试剂盒提取、匀浆＋试剂盒提取、匀浆＋溶葡酶＋试剂盒提取共7种方法对模拟样本进行细菌核酸提取,特异性地扩增16S r DNA的V1~V2高变区,测序后分析模拟样本中各种细菌的含量和相对分布。结果：超声波处理结合试剂盒提取方法中不同细菌数据分布及含量都相对均匀,是一种广谱、高效的细菌核酸提取方法。结论：超声波处理结合试剂盒提取方法适用于细菌宏基因组测序中样本核酸的提取。

16S核糖体RNA基因测序技术在口腔微生物多样性中的研究进展

16S核糖体RNA(16S ribosomal RNA,16S r RNA)基因是鉴定微生物最常用的分子标志物,被应用于第1代、第2代和第3代测序技术。大量关于16S r RNA基因的研究使人类对口腔微生物多样性的理解更加深入。在健康口腔中,微生物多样性在不同的时间或空间具有差异性。随着口腔疾病(如龋病、牙周病或口臭)的发生或发展,微生物多样性将发生改变。

泛素—核糖体蛋白S27a基因的克隆、测序及其原核GST融合表达和纯化

目的:克隆泛素—核糖体蛋白S27a基因并在大肠杆菌细胞内高效表达,并纯化该蛋白。方法:从HL-60细胞中提取总RNA,通过RT-PCR扩增获得泛素/核糖体蛋白S27a的编码区cDNA,将HindⅢ/NdeⅠ双酶切的PCR产物连接到同样双酶切的GST融合表达载体pGEXGST构建为融合表达质粒pGEXGST-S27a,转化感受态的大肠杆菌JM109实现质粒的扩增与纯化,经DNA测序确证后再转化感受态表达菌BL21,表达并纯化出融合蛋白。结果:(1)PCR扩增获得长约560bp的泛素—核糖体蛋白S27a基因片段。(2)SDS-PAGE证明,泛素—核糖体蛋白S27a-GST融合蛋白的分子量为43kDa。(3)通过过柱法纯化出泛素—核糖体蛋白S27a-GST融合蛋白。结论:成功克隆出泛素-核糖体蛋白S27a的基因,并在表达菌BL21中可见GST融合表达,并纯化出该融合蛋白,为进一步研究其功能获得了候选蛋白分子。

16S-rRNA测序技术分析早产儿肠道细菌基因组指导新生儿坏死性小肠结肠炎手术时机选择的研究

目的探讨16S-rRNA测序技术分析早产儿肠道细菌基因组指导新生儿坏死性小肠结肠炎(NEC)手术时机选择。方法前瞻性选择2021年1月至2022年6月百色市人民医院需要手术治疗的NEC患儿30例为观察组,选择同期内科保守治疗的Ⅰ期15例和Ⅱa期15例患者为对照组。采用HiSeq测序平台,借助双端测序模式进行高通量二代测序,比较两组多样性指数、优势均属丰度及不同优势菌比值等;绘制受试者操作特征(ROC)曲线,分析16S-rRNA测序技术的指导价值。结果60例患者60份样本中共获得细菌84个,且两组样品均为副杆状菌属最高,其次为Ruminococcus、Blautia、Aeromonas和Fusobacterium;两组肠道菌群上述菌门丰度存在差异(P<0.05);从粪便标本中共获得有效序列7347481条,人均130857条,测序平均覆盖度为(92.15±5.61)%;观察组手术治疗的NEC患儿中香农-维纳(Shannon)及辛普森多样性(Simpson)指数低于对照组内科保守治疗患儿,差异有统计学意义(P<0.05);ROC曲线结果表明,16S-rRNA测序技术在NEC患儿手术时机选择中的指导AUC为0.846,指导灵敏度为87.51%,特异度为83.16%。结论NEC患儿常伴有肠道细菌基因组改变,且菌群结构的变化与患儿病情严重程度有关,通过16S-rRNA测序技术能指导NEC患儿手术治疗时机。

基于16S rRNA基因及宏基因组测序解析藏猪肠道菌群组成特征

【目的】旨在通过分析藏猪肠道菌群组成及其功能注释,探讨藏猪肠道菌群与其耐粗饲和抗逆性能的关系。【方法】以66头藏猪粪便微生物为试验材料,提取DNA样本,利用16S rRNA基因测序技术分析在门水平和属水平藏猪的肠道菌群组成,构建共有核心菌的菌群互作网络,结合27头藏猪肠道微生物宏基因组测序数据,进行KEGG通路和碳水化合物代谢酶(CAZymes)数据库注释分析,以期阐明与藏猪纤维代谢能力强和抗病力等优良特性相关的功能通路。【结果】(1)16S rRNA测序分析结果显示,拟杆菌门(Bacteroidetes)(39.34%~60.72%)和厚壁菌门(Firmicutes)(24.65%~38.5%)在藏猪肠道微生物门水平上占优势,而在属水平则依次是普雷沃氏菌属(Prevotella)、密螺旋体属(Treponema)和琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)的丰度最高;(2)利用Cytoscape软件构建藏猪肠道样品中共有的26个核心菌属之间的互作网络,各菌群在网络中存在合作关系和竞争关系,证明藏猪肠道菌群结构比较稳定;(3)宏基因组鸟枪法测序结果显示,在KEGG功能注释中藏猪肠道主要富集营养物质合成代谢和遗传信息处理相关通路,包括氨基酸的生物合成、碳代谢、群体感应通路等。此外,使用CAZymes数据库注释显示藏猪肠道中的糖基转移酶(GTs)基因家族相对丰度最高,主要为GT2、GT4和GT41基因,其次是糖苷水解酶基因家族(GHs)的GH13、GH2和GH3基因。【结论】藏猪具有丰富且独特的微生物组成和功能通路,与免疫和抗病相关的疣微菌门(Verrucomicrobia)和阿克曼氏菌(Akkermansia)是藏猪肠道特有的高丰度菌属,可能与藏猪适应高海拔低氧低温的环境及其抗病性能有关;与粗纤维代谢相关的密螺旋体属Treponema、Sphaerochaeta、纤维杆菌属Fibrobacter在藏猪肠道中富集,能够帮助藏猪降解饲粮中的粗纤维,适应半放牧的饲养模式。研究结果有助于了解肠道微生物在藏猪耐粗饲和抗逆性中的作用机制,为今后对藏猪优良特性的开发利用提供新的思路。

基于UPLC-Q-Orbitrap HRMS代谢组学和16S rRNA基因测序探讨骨疏丹补肾机制

目的 整合代谢组学和肠道微生物组学的研究策略探讨骨疏丹(Gushudan, GSD)预防氢化可的松诱导的肾阳虚证(kidney-yang deficiency syndrome, KYDS)大鼠的补肾作用机制。方法 分别采用超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Q-Orbitrap HRMS)的非靶向代谢组学和16S rRNA基因测序分析的肠道微生物组学方法,分析正常对照组、肾阳虚证模型组、骨疏丹给药组和阳性对照组大鼠粪便代谢物谱与肠道菌群组成,采用Pearson相关分析探讨内源性差异代谢物与差异菌群之间的相关性。结果 基于UPLC-Q-Orbitrap HRMS的代谢组学方法在正负离子模式下共发现骨疏丹参与调控肾阳虚症的22种差异代谢物,如色氨酸、鹅去氧胆酸、肌酐和油酸酰胺等,主要涉及氨基酸代谢、胆汁酸代谢、能量代谢和脂质代谢。基于16S rRNA测序分析发现骨疏丹在属水平显著上调普雷沃氏菌(Prevotellaceae)的相对丰度(P<0.05),显著下调颤杆菌(Oscillibacter)的相对丰度(P<0.05)。相关性分析结果表明甘胆酸和鹅去氧胆酸与在属水平显著改变的普雷沃氏菌(Prevotellaceae)显著正相关(P<0.05),而与考拉杆菌(Phascolarctobacterium)显著负相关(P<0.05)。二十二碳六烯酸与毛螺菌(Lachnospiraceae)显著负相关(P<0.05)。结论 骨疏丹通过良性调节内源性代谢和肠道菌群结构发挥补肾作用,为中药通过肠-肾轴治疗疾病提供新的思路和方法。

基于16S rRNA基因测序技术分析急性肝内胆汁淤积大鼠的肠道菌群

目的 探讨ANIT诱导的大鼠急性肝内胆汁淤积(acute intrahepatic cholestasis,AIC)与肠道菌群的关系。方法 以SPF级的SD大鼠为实验对象,随机分为正常对照组、模型组,每组24只,依据取材时间不同又将各组随机分为24 h、48 h、72 h 3个亚组,每组8只。模型组通过一次性予2%ANIT按100 mg·kg^(-1)·d^(-1)灌胃造模诱发AIC模型,正常对照组予等容积色拉油灌胃。通过高通量测序法对肠道粪便细菌16S rRNA的V_(3)~V_(4)区进行基因测序及生物信息学分析。结果 AIC造模后,随着时间增加,α多样性指数逐步升高,造模72 h组相比造模24 h组,Shannon指数有显著性差异;β多样性发现,利用基于加权Unifrac距离PcoA分析或NMDS分析均显示:正常对照组、造模24 h组和造模48 h组的肠道菌群显示比较明显的聚集效应;在门水平上,厚壁菌门(Firmicutes)丰度在造模48 h后显著下降,变形菌门(Proteobacteria)的丰度显著上升,拟杆菌门(Bacteroidetes)的丰度显著上升;LEfSe对组间差异显著的物种分析结果显示,LDA值大于4的微生物类群有35个。结论 模型组干预后大鼠肠道菌群结构和多样性均发生显著变化。

基于16S rRNA基因测序技术分析原发性胆汁性胆管炎伴抑郁小鼠粪便样本中肠道菌群的变化

背景:肠道菌群失调或紊乱与脑和肝脏疾病之间存在联系,肠道菌群可能通过肠⁃肝⁃脑轴影响原发性胆汁性胆管炎(PBC)和抑郁的发生和发展。目的:应用16S rRNA基因测序技术分析PBC伴抑郁小鼠的肠道菌群情况。方法:将12只雌性小鼠随机分为对照组、胆汁淤积组、胆汁淤积+抑郁组和治疗组。对照组小鼠给予正常饲料和水喂养;胆汁淤积组小鼠采用含0.1%DDC的饲料连续喂养2周构建胆汁淤积模型;胆汁淤积+抑郁组小鼠先采用慢性温和不可预期应激方式刺激2周,再以含0.1%DDC的饲料喂养2周构建胆汁淤积+抑郁模型;治疗组小鼠在构建胆汁淤积+抑郁模型的基础上,腹腔注射盐酸氯米帕明(7.5 mg·kg^(-1)·d^(-1))2周。造模期间观察小鼠的行为学变化。造模结束后各组小鼠称重,行负重游泳试验、强迫游泳试验、悬尾试验和肝组织HE染色;采集新鲜粪便,基于16S rRNA基因测序技术分析小鼠肠道菌群的变化。结果:与对照组相比,胆汁淤积组和胆汁淤积+抑郁组小鼠体质量明显减轻(P<0.05),抑郁样行为明显加重(P<0.05);与胆汁淤积+抑郁组相比,治疗组小鼠体质量明显升高(P<0.05),抑郁样行为明显减轻(P<0.05)。胆汁淤积组、胆汁淤积+抑郁组和治疗组小鼠肝组织出现不同程度的胆汁淤积性损伤;与胆汁淤积+抑郁组相比,治疗组肝脏病理损伤明显减轻。小鼠粪便样本经测序抽平处理后获得个5491个操作分类单元(OTU),4组共有的OTU为162个。对照组与胆汁淤积组、胆汁淤积+抑郁组和治疗组小鼠粪便中微生物多样性和群落组成存在较大差异。在门水平上,胆汁淤积组厚壁菌门(Firmicutes)丰度明显升高;胆汁淤积+抑郁组变形菌门(Proteobacteria)丰度明显升高;治疗组厚壁菌门和变形菌门丰度均明显升高,拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度明显下降。对组间差异显著的物种行LEfSe分析发现,LDA值>4的微生物类群有38个。结论:PBC伴抑郁小鼠的肠道菌群结构和多样性均发生显著变化,抗抑郁治疗能改善肠道菌群的丰度和多样性,通过调节肠道菌群治疗PBC伴抑郁有可能成为一种新的治疗策略。

基于16S rRNA基因测序探究参地消银颗粒对血热湿滞毒蕴型银屑病患者肠道菌群的影响

目的:基于16S rRNA基因测序技术研究参地消银颗粒对血热湿滞毒蕴型银屑病患者肠道菌群的影响,进一步阐明血热湿滞毒蕴型银屑病患者肠道菌群与健康人群之间的差异。方法:选取符合纳入标准的血热湿滞毒蕴型银屑病患者24例,随机分为患病组、参地消银颗粒治疗组、复方青黛胶囊对照组,同时纳入12名健康志愿者为正常对照组。收集患者入院前及入院8周后的粪便样本以及健康志愿者体检当日的粪便样本,进行16S rRNA V3V4区段的基因测序分析不同菌属的相对丰度;利用QIIME2软件进行操作扩增子序列变异(ASV)的划分,对物种注释及丰度分析;通过α多样性(alpha diversity)和β多样性分析(beta diversity),揭示样本中物种组成和样本间群落结构的差异,通过功能预测分析在KEGG Pathway层面了解群落样本行使的生物学功能;对数据进行独立样本t检验和Mann-Whitney U检验以进行统计分析。结果:与正常对照组比较,患病组的肠道菌群在门水平上拟杆菌门丰度下降,而厚壁菌门丰度则富集;特别是考拉杆菌属的丰度在患病组中降低最明显。给予参地消银颗粒治疗后,显著改善患者的肠道菌群结构,特别是在厚壁菌门和拟杆菌门的比例上显示出较好的调节效果;此外,通过alpha和beta多样性分析,进一步揭示了治疗前后肠道菌群的多样性和群落结构的差异。功能预测分析显示,患病组的肠道菌群功能在核糖体、嘌呤代谢、嘧啶代谢以及氨基糖和核苷酸糖的代谢等生物学通路上与正常对照组存在一定程度差异。结论:参地消银颗粒通过调节肠道菌群的组成,尤其是在提高考拉杆菌属的丰度方面显示出显著效果,有助于恢复血热湿滞毒蕴型银屑病患者的肠道微生态平衡,从而可能影响疾病的进程和治疗效果。

结合宏基因组末端随机测序和16S rDNA技术分析温室黄瓜根围土壤细菌多样性

土壤细菌在温室土壤环境中具有十分重要的生态功能,与温室作物以及微生物内部存在互作关系。研究土壤细菌的群落结构组成,有助于了解土地利用变化与生态环境效应之间的关系。结合16S rRNA基因克隆文库和宏基因组末端测序对温室黄瓜根围土壤细菌的多样性进行了分析。在16S文库中,根据97%的序列相似性水平划分OTU,共有35个OTU,其中优势菌群是γ-Proteobacteria,其次为Firmicutes,Bacillus为优势细菌。在纲分类水平上,16S文库和宏基因组末端测序结果均包含γ-Proteobacteria、α-Proteobacteria、δ-Proteobacteria、β-Proteobacteria、Actinomycetales和Firmicutes,各纲比例有差别;在优势种群属水平上,末端测序的结果包含的属多于16S文库(40>35);在优势细菌种类上,两者反映的结果一致,均为Bacillus。但是,宏基因组末端测序包含了大多数的弱势种群,更能反映细菌多样性的真实水平。与露地土壤细菌16S文库相比较,土壤细菌多样性降低,这可能与温室多年连作,种植蔬菜种类单一直接相关。

鸡源志贺菌16SrRNA基因克隆、测序及同源性分析

目的:建立鸡源志贺菌的16SrDNA序列分析方法从而进一步从基因水平鉴定鸡源鲍氏志贺菌。方法:用PCR扩增出鸡源鲍氏志贺菌16SrRNA的部分基因(16SrDNA)并测序,将所获得的序列与GenBank中人志贺菌序列相比较,计算种间相似性,并构建志贺菌的系统发育树,对分离株进行分类与鉴定。结果:首次研究发现鸡源志贺菌的16SrDNA序列与已知的人鲍氏志贺菌同源关系最近,同源性达99·7%,与人福氏志贺菌的同源性为96·0%。结论:16SrDNA序列分析鉴定志贺菌是一种快速、可靠的方法。

基于16S rDNA测序分析酒精性脂肪肝病进展中小鼠肠道菌群变化

目的:采用16S rDNA测序技术分析酒精性脂肪肝病(AFLD)发展过程中小鼠肠道菌群的变化,并探讨小鼠AFLD进展的可能机制。方法:将60只雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组(35只)和模型组(25只)。适应性喂养5 d后,对照组小鼠每天喂食Lieber-DeCarli对照流质饲料(TP4030C),模型组小鼠每天喂食含有4%乙醇的Lieber-DeCarli流质饲料(TP4030B),连续30 d后,采用苏木精—伊红(HE)染色法观察肝脏病理变化;16S rDNA测序法分析肠道菌群组成结构。结果:与对照组相比,AFLD模型组小鼠肠道菌群的α多样性结果显示其物种丰富度降低(P<0.05)。Beta多样性结果表明两组小鼠肠道菌群结构组成和丰度存在显著差异(P<0.05)。与对照组相比,模型组粪杆菌属(Faecalibaculum)、杜博菌属(Dubosiella)、异杆菌属(Allobaculum)、瘤胃球菌属UCG-013(Ruminococcaceae UCG-013)等菌属相对丰度升高,乳酸杆菌属(Lactobacillus)、毛螺菌属(Lachnospiraceae NK4A136 group)等菌属相对丰度降低。模型组小鼠肠道菌群在丙氨酸转移酶、谷胱甘肽水解酶和组蛋白乙酰转移酶通路活性显著增加(P<0.05)。结论:含4%乙醇的Lieber-DeCarli流质饲料成功构建了AFLD C57BL/6小鼠模型,AFLD小鼠肠道菌群的结构和组成均发生变化,酒精可能通过破坏肠道微生物稳态,增加丙氨酸转移酶、谷胱甘肽水解酶和组蛋白乙酰转移酶通路活性加快AFLD的进展。

基于16S rRNA基因测序技术分析非酒精性脂肪性肝病大鼠的肠道菌群

目的 基于16S rRNA基因测序技术分析非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)大鼠的肠道菌群。方法 以SPF级SD大鼠为实验对象,随机分为普通饮食组(对照组)和高脂饮食组(模型组)。高脂饮食组通过进食高脂饲料8周诱发NAFLD模型。8周后检测大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、甘油三酯(triglyceride,TG)和总胆固醇(total cholesterol,TC)水平,取肝组织进行HE及油红O染色,采集大鼠新鲜粪便通过高通量测序法对肠道粪便细菌16S rRNA的V3-V4区进行基因测序。利用UPARSE软件进行类单元(operational taxonomic unit,OTU)聚类,采用RDP Classifier算法对OTU代表序列进行比对分析,并在门、纲、目、科、属、种等水平上进行注释其群落的物种信息。基于OTU聚类结果,利用mothur软件和Qimme(V.1.8)进行Alpha多样性分析和Beta多样性分析,并通过LEfSe软件进行组间菌落差异分析。结果 与正常组相比,模型组大鼠AST [(23.63±4.82)U/L vs (10.61±1.17)U/L]、ALT [(9.98±2.27)U/L vs(3.40±0.81)U/L]、LDL-C [(0.69±0.11)mmol/Lvs(0.34±0.10)mmol/L]、TG [(0.90±0.24)mmol/L vs (0.33±0.13)mmol/L]及TC [(5.69±0.72)mmol/L vs(2.10±0.42)mmol/L]水平均显著升高,HDL-C [(0.62±0.14)mmol/L vs (1.07±0.17)mmol/L]水平显著降低,差异均有统计学意义(P均<0.05)。两组共获得2607个OTU,经过抽平处理后获得2547个OTU,其中对照组2367个,模型组2168个,两组共享OTU为1988个。随样本量增加物种累积曲线趋于平缓,表明样本量充分。在Alpha多样性指数中,模型组的香农指数(7.0673±0.4812 vs 6.1695±0.7165)、物种个数[(968.6250±233.0221)个vs (1155.9500±129.0011)个]和PD_Whole_Tree指数(69.3449±14.2872vs82.0219±10.2012)显著低于对照组,差异有统计学意义(P均<0.05),Chao1指数也低于对照组(1418.4503±277.8639 vs 1599.1725±100.1048),但差异无统计学意义(P>0.05)。采用主成分分析、主坐标分析、层次聚类分析、偏最小二乘法判别分析和非度量多维尺度法等Beta多样性分析方法均能将模型组与对照组大鼠完全区分开来,进一步说明二者间的菌群有明显区别。采用RDP Classifier算法对OTU代表序列进行比对分析,结果表明,从门水平分析,NAFLD大鼠厚壁菌门和放线菌门丰度增加,其中放线菌门丰度显著增加,拟杆菌门和变形菌门的丰度降低。从纲水平分析,NAFLD大鼠放线菌纲和丹毒丝菌纲相对丰度显著升高,而杆菌纲相对丰度显著下降。从目水平分析,NAFLD大鼠红椿菌目和丹毒丝菌目相对丰度显著升高,而乳杆菌目和酸微菌目相对丰度显著降低。从科水平分析,NAFLD大鼠毛螺菌科(Lachnospiraceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcus)、丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae)和双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)等增加,其中双歧杆菌科、肽链球菌科显著增加,乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)和拟杆菌目S24-7组比例下降,其中乳酸杆菌科显著性减少。采用LEfSe对组间差异显著的物种分析,结果表明两组间差异起重要作用的肠道微生物类群共126个,LDA值大于3.6的微生物类群共24个。结论与普通饮食组相比,高脂饮食组干预8周后大鼠肠道菌群结构和多样性均发生显著变化。

应用16S rRNA基因测序比较分析不同品系1型糖尿病小鼠肠道菌群的异同

目的比较C57BL/6(B6)和FVB两个品系小鼠建立的1型糖尿病(T1DM)模型肠道菌群组成和多样性的异同,为探索两模型在T1DM相关肠道菌群研究中的进一步应用提供背景数据。方法采用8周龄SPF级雄性B6和FVB小鼠各20只,两组小鼠每天腹腔注射40 mg/kg的链脲佐菌素(STZ)连续5 d,小鼠空腹血糖连续2周≥11.1 mmol/L为T1DM建模成功,建模6周后每组分别收集10份洁净粪便,进行16S rRNA基因V3-V4区测序,分析粪便中肠道菌群的Alpha多样性、Beta多样性、优势菌科及肠道菌群相关的功能通路。结果B6与FVB组T1DM小鼠肠道菌群的Alpha多样性和丰富度没有显著差异(P>0.05),两组小鼠的菌群Beta多样性存在统计学上的差异(P<0.05)。B6组T1DM小鼠肠道的优势菌科为Muribaculaceae、Lactobacillaceae、Lachnospiraceae、Prevotellaceae、Desulfovibrionaceae、Akkermansiaceae;FVB组T1DM小鼠肠道的优势菌科为Lactobacillaceae、Muribaculaceae、Lachnospiraceae、Prevotellaceae、Clostridiales_unclassified、Saccharimonadaceae、Marinifilaceae;两组中共有的优势菌科在比例上差异很大。B6与FVB组的厚壁菌门与拟杆菌门的比值都显著增加。两组T1DM小鼠肠道菌群的功能通路集中在以氨基酸、糖代谢及核苷酸的代谢途径中。结论两组T1DM小鼠肠道菌群Alpha多样性无差异,但肠道菌群的组成及比例差异较大,优势菌群在不同模型中的组成比例发生了改变。

分析方法对细菌群落16S rRNA基因扩增测序分析结果的影响

细菌16S rRNA基因扩增测序是当前环境微生物组学研究中应用最为广泛的方法之一。然而,测序序列最小分类单元的划分有多种方式,其对微生物多样性下游分析结果的影响还有待进一步探究。本研究通过提取5组环境样本(森林、农田、湿地土壤、湖泊沉积物和水体)的DNA进行16S rRNA基因扩增测序,对测序结果同时采用5种最小分类单元的划分方式(基于97%、98%、99%和100%序列相似性聚类的OTU以及基于DADA2算法得到的ASV)进行划分,比较分析最小分类单元划分方法对微生物群落多样性、组成、以及其与环境因子关联性分析造成的影响。结果表明,提高分类分辨率,能够获得更高的群落α多样性(Chao1和Shannon)和β多样性(P < 0.05),而相对于按序列相似性聚类的OTU,ASV方法会在一定程度上降低Chao1和PD指数。对于群落组成,分类单元的划分方式主要影响微生物组一些低丰度属(< 0.2%)的占比,而对较高的分类学水平(门水平)组成的影响较小。此外,冗余分析的结果表明,提高分类分辨率水平,能够使得环境因子对微生物群落能够获得更高的解释度,同时也会影响各环境因子对群落组成的解释度排序。总之,本研究明晰了最小分类单元的不同划分方式会对微生物组多样性、组成以及与环境因子的关联性造成的影响,为后续环境微生物组学研究提供了理论指导。

基于16S rDNA高通量测序技术研究转基因作物对根际细菌群落结构的影响

近几年,随着分子生物学的发展,以16S rDNA基因为分子标记的高通量测序技术凭借低成本、高通量、流程自动化的优势为研究转基因作物对根际细菌群落结构的影响提供了新的技术平台。归纳介绍了基于16S rDNA扩增子高通量测序技术在评价转基因作物对根际细菌群落结构及多样性等方面应用的研究进展,总结了16S rDNA扩增子高通量测序技术应用中存在的问题,并分析展望其在土壤微生物多样性研究中的发展趋势。

16S rRNA基因测序技术在肝脓疡细菌鉴定中的作用(英文)

目的评价16S核糖体RNA(rRNA)基因测序在肝脓疡中细菌鉴定中的应用价值。方法2012年1月—2013年12月间共20例肝脓疡行经皮置管引流的患者,分别行脓液培养,血培养和16S rRNA基因测序。利用454 GS Junior System对脓液基因组DNA行PCR和16S rRNA基因测序。脓液培养,血液培养和16S rRNA基因测序结果进行分别评价。结果脓液和血液培养阳性的患者分别是9例(45%)和4例(20%)。16S rRNA基因测序细菌鉴定率为90%,明显高于传统的培养方法。结论 16S rRNA基因测序方法较传统的培养方法能更准确和有效对肝脓疡进行细菌鉴定。

基于16S rRNA基因扩增子测序技术研究云南野生小型哺乳动物肠道菌群多样性

以生活在同一生境,但具有不同进化关系和不同食性的野生哺乳类动物(鼠科、猬科和鼩鼱科)为研究对象,通过16S rRNA基因扩增子测序,分析和比较其肠道菌群。共识别出5378个操作分类单位(OTUs),主要隶属Firmicutes(40.55%),Proteobacteria(34.60%)和Bacteroidetes(13.67%)。Firmicutes和Bacteroidetes是鼠科的优势菌门,Proteobacteria是猬科和鼩鼱科的优势菌门。多样性分析表明,鼠科、猬科与鼩鼱科的肠道微生物多样性及群落结构具有显著性差异;LEfSe分析表明,鼠科中存在更多与复杂碳水化合物发酵相关的细菌,猬科和鼩鼱科中含较多氨基酸发酵菌;益生菌(如Lactobacillus和Lactococcus等)共存于这3类野生小型哺乳类动物中,起调控宿主健康的作用。研究结果揭示,宿主食性与进化关系影响着野生小型哺乳动物肠道菌群结构,而肠道菌群可能在多种方面对宿主起益生作用。

植物内生菌16S rRNA基因扩增子高通量测序中降低宿主污染的方法

植物内生菌能够帮助植物生长,增强其抗逆性与抗病性,研究植物内生菌对了解植物入侵机制、保护生态环境与农业的健康发展具有重要意义。通过阅读相关文献,总结归纳了降低植物内生菌16S rRNA基因扩增子高通量测序(16S-seq)中宿主基因污染的4种方法,即:①寻找特异性错配引物用来扩增细菌16S rRNA基因;②添加特异性阻断物用来抑制宿主16S rRNA基因扩增,如PNA-PCR和LNA-RCR钳位技术;③在文库构建过程中剪切宿主细胞器的16S rRNA基因,如Cas-16S-seq方法;④改变PCR扩增流程,如巢式PCR技术。了解上述各种方法的特点,有助于在植物内生菌16S-seq中选择合适的方法,避免或者减少宿主基因的污染,更准确地进行植物内生细菌群落的研究。

基于16S rRNA基因序列分析家蚕肠道细菌的多样性

家蚕肠道菌群与蚕体对营养物质的消化吸收及健康性密切相关。为了解家蚕肠道细菌的多样性及雌、雄个体间肠道细菌类群的差异,通过应用454焦磷酸测序技术检测细菌16S rRNA基因序列的方法分析家蚕5龄第3天雌、雄幼虫中肠内容物中的细菌类群,共发现5 578个分类操作单元(operational taxonomic units),包括14个门、21个纲、30个目、71个科、120个属的细菌,雌、雄个体在上述分类阶元共有的肠道细菌菌群分别为8、9、20、38和46种。在属水平上对细菌菌群构成的分析显示,雄蚕肠道中的主要优势细菌为代尔夫特菌属Delftia、橙单胞菌属Aurantimonas、肠球菌属Enterococcus、嗜糖假单胞菌属Pelomonas、青枯菌属Ralstonia、台湾温单胞菌属Tepidimonas、假单胞菌属Pseudomonas、阿斯普罗单胞菌属Aspromonas、甲基杆菌属Methylobacterium和葡萄球菌属Staphylococcus;雌蚕肠道中的主要优势细菌为代尔夫特菌属Delftia、橙单胞菌属Aurantimonas、假单胞菌属Pseudomonas、嗜糖假单胞菌属Pelomonas、佩特罗菌属Petrobacter、肠球菌属Enterococcus、台湾温单胞菌属Tepidimonas、狭义的梭菌属Clostridium sensu stricto、阿斯普罗单胞菌属Aspromonas。其中,雄蚕肠道中有23个属的细菌丰度是雌蚕的1.5倍以上,在雌蚕肠道中有7个属的细菌丰度是雄蚕的1.5倍以上,表明雌性与雄性家蚕肠道细菌类群的组成和比率存在明显差异。基于16S rRNA基因序列的聚类分析显示,家蚕肠道中的优势细菌属可分为2个大类。家蚕肠道细菌的多样性研究结果可作为探讨雌蚕和雄蚕经济性状差异的新线索。