基于16SrRNA和16S-23SrRNA基因间隔区序列探讨陆生和水生螺原体菌株的系统发生关系

采集江苏省养殖池塘内发病的中华绒螯蟹、克氏原螯虾和南美白对虾,利用已有螺原体16S rRNA和23S rRNA基因序列保守引物扩增并测序16S rRNA和16S-23S rRNA基因间隔区序列(ISRs).基于已获得的序列和GenBank中下载的螺原体序列分别进行同源性比对,比对的结果分别利用PAUP软件和MrBayes软件提供的最大似然法和贝叶斯法进行系统发生关系分析.分析结果是:所有淡水甲壳动物螺原体菌株Spiroplasma erio-cheiris(中华绒螯蟹)、Spiroplasmasp.CRAYFISH(克氏原螯虾)、Spiroplasmasp.SHRIMP(南美白对虾)严格聚为一支,并且与陆生兔扁虱螺原体(非凡螺原体)Spiroplasma mirum关系最近,而与中国报道的陆生植物螺原体菌株Spiroplasmasp.CR-1(油菜)、Spiroplasmasp.CNR-1(油菜)、Spiroplasmasp.CNR-2(油菜)、Spiroplasmasp.CAN-1(杜鹃花)、Spiroplasmasp.CRW-1(红花酢浆草)及昆虫螺原体菌株Spiroplasmasp.CH-1(蜜蜂)、Spiroplas-masp.M10(蜜蜂)关系较远,此外,3个淡水甲壳动物螺原体菌株与现今唯一报道的海水南美白对虾螺原体Spi-roplasma penaei系统发生关系也很远.因此,在螺原体属中,我国发现的淡水甲壳动物螺原体近缘种是非凡螺原体而不是我国陆生昆虫或植物螺原体及美洲的南美白对虾螺原体.

16SrRNA基因与16S-23SrRNA转录单元内间隔区序列分析及其在节旋藻和螺旋藻分类鉴定中的应用

测定了节旋藻属 3个品系和螺旋藻属 1个品系的全长 1 6SrRNA基因和 1 6S 2 3SrRNA转录单元内间隔区序列 (ITS) ,分析了已知的节旋藻、螺旋藻和相关品系的相应序列的同源性 ,构建了系统发生树 ,并评价了这两段DNA序列在节旋藻、螺旋藻种属分类和种质鉴定中的意义。结果表明 :( 1 ) 1 6SrRNA基因序列和ITS序列均可用于节旋藻属和螺旋藻属的属间分类 ,以两序列为基础的系统学分析结果一致 ;( 2 )ITS序列变异程度高于 1 6SrDNA序列 ,适用于节旋藻和螺旋藻属内品系或种质鉴定 ;( 3)节旋藻属可明确界定 ,1 6SrRNA基因序列相似性大于 98% ,ITS序列相似性大于 88% ;( 4 )螺旋藻属某些品系间 1 6SrDNA序列和ITS序列相似性较低 ,与不同属间的序列相似性程度为同一水平。

分支杆菌临床分离株的16S-23S rRNA基因转录间隔区的序列分析

目的 建立鉴定分支杆菌分离株的 16S - 2 3SrDNA转录间隔区 (internaltranscribedspacer ,ITS)序列分析的方法 ,用该方法对临床分离株进行鉴定。方法 对从重庆某医院分离的 2 9株分支杆菌菌株分别进行了PCR扩增 ,得到它们的16S - 2 3SrDNAITS片段 ,并测定所得到片段的DNA序列。用DNA分析软件将所获得的序列与GenBank的分支杆菌序列相比较 ,计算种间相似性 ,并用序列构建分支杆菌菌株的系统发育树 ,对分离株进行鉴定。结果 在ITS序列分析中 ,有 10株的序列分别与结核分支杆菌复合群 (Mycobacteriumtuberculosiscomplex ,MTC)、戈登分支杆菌 ,脓肿分支杆菌的序列完全一致。依据完全一致的序列可以准确鉴定这些临床分离株为相应的种 ;4株 16SrDNA序列分析不能准确鉴定的分离株中其中 3株(M 4、M 5、M 12 )鉴定为戈登分支杆菌 ,1株 (M 2 3)鉴定为脓肿分支杆菌。部分分离株的的ITS序列在GenBank序列检索中无完全一致的匹配序列 ,这些不同的序列之间的相似程度为 2 7.1%～ 99.2 %。用临床分离株的ITS序列与其最相似的已知分支杆菌的ITS序列构建的系统发育树 ,菌株分群与 16SrDNA序列构建的系统发育树的分群基本一致。结论 分支杆菌的16S - 2 3SrDNAITS序列比 16SrDNA序列有更大的多样性 。

12种寄主来源的茄科雷尔氏菌16S-23S rDNA间隔区序列比较

应用PCR方法，获得了分离自广东番茄、茄子、辣椒、烟草、空心茱、沙姜、姜、马铃薯、花生、菊花、桑树和藿香等12种作物21个茄科雷尔氏菌菌株的16S-23SrDNA间隔区序列（ITS）。序列分析结果表明，除HZ-1菌株外，其余20个茄科雷尔氏菌菌株ITS序列长均为503bp，序列间相似性99．2％～100％，序列间差异仅1～4bp；而HZ-1菌株的ITS序列长为498bp，与其他菌株的ITS序列相似性为95．4％～95．6％。这些结果说明，这21株来源于12种不同寄主的茄科雷尔氏菌菌株的16S-23SrDNAITS序列比较保守。系统进化分析显示，仅菌株HZ-1聚类于茄科雷尔氏菌区组2中，其余20个菌株均聚类于茄科雷尔氏菌区组1中。

柑橘黄龙病菌亚洲种16S rDNA和16S-23S rDNA间隔区的PCR-RFLP及序列分析

为明确柑橘黄龙病菌的遗传多样性,PCR扩增了6个不同地区黄龙病菌的16SrDNA和16S-23S rDNA间隔区(intergenic spacer regions,ISR),分别通过4种内切酶对其进行了限制性片段长度多态性分析,发现不同分离物的16S rDNA和16S-23S rDNA间隔区各酶切产物的电泳谱带完全一致,未表现多态性。对16S-23SrDNA ISR进行了克隆和测序,经DNAman和NCBI Blast比对分析发现,6个分离物16S-23SrDNAISR序列之间不存在碱基差异,与数据库中柑橘黄龙病菌亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus)同源性高达99.0%～100%。系统发育分析显示所有的Ca.L.asiaticus归为一个类群,而后与Ca.L.africanus、Ca.L.americanus和Ca.L.psyllaurous组成韧皮部杆菌属(Candidatus Liberibacter)一个大的类群。结果表明,同一种柑橘黄龙病菌不同分离物16S rDNA和16S-23S rDNAISR无分子变异或变异较小,不存在遗传多样性。

基于16S-23S rDNA间隔区序列(ITS)、REP序列的基因指纹图谱及UPGMA聚类法的拟诺卡菌属分类方法

拟诺卡菌属(Nocardiopsis)是拟诺卡菌科(Nocardiopsaceae)的唯一属.该属内进行物种鉴别时通常是在多相分类方法基础上,以全基因组杂交同源性在70%以下的为不同物种,此为国际公认的定种标准;但在进行大量菌株的比对时操作比较复杂,于是多种基于DNA的基因图谱技术发展起来.本实验利用适宜引物,对拟诺卡菌属15株基准株基因组DNA的16S-23S rDNA间隔区序列(ITS)和REP序列进行了扩增,获得了两种基因指纹图谱,同时根据UPGMA聚类法构建了相应的进化距离树图.结果表明,对于拟诺卡菌属中不同物种的区分,两种基因图谱技术的分辨力相当,均可以较好的呈现物种间差异,可以作为拟诺卡菌属菌株多相分类的组成部分,应用于物种水平的分类与鉴定.

54株分枝杆菌国际标准株16S-23S rRNA转录间隔区序列分析

目的分析54株分枝杆菌国际标准株16S-23SrRNA转录间隔区(ITS)序列,为临床分离株的鉴定提供参考。方法用16S-23SrRNA ITS序列分析法对54株分枝杆菌国际标准株进行分析,构建系统发育树,计算相似性百分比。结果除灰尘与微黄分枝杆菌;田野与千田分枝杆菌;抗热与副偶然分枝杆菌,奥布与母牛结核分枝杆菌;杜氏与猪分枝杆菌;金色与东海分枝杆菌,海与溃疡分枝杆菌、科莫斯分枝杆菌;2株结核分枝杆菌与田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌的16S-23SrRNA ITS序列完全相同无法鉴别外,其他各分枝杆菌菌种间16S-23SrRNAITS序列均不相同,可以得到很好的鉴别。结论 16S-23SrRNA ITS序列分析是一种很好的鉴定分枝杆菌的方法,国际标准株16S-23SrRNA ITS序列的研究弥补了基因数据库的不足。

16S-23S rDNA内转录间隔区序列寡核苷酸探针鉴定分支杆菌菌种的研究

目的 研究以16S-23S rDNA 内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列为靶基因设计分支杆菌菌种寡核苷酸探针,应用PCR-反向杂交技术快速鉴定分支杆菌菌种。方法 应用PCR-反向杂交技术检测26种36株分支杆菌标准株,24株分支杆菌临床分离株。结果 分支杆菌标准株和临床分离株经PCR扩增,依菌种不同可见一条约340bp-450bp范围DNA片段。探针特异性试验表明,21种寡核苷酸探针除草分支杆菌探针。MPH与微黄分支杆菌亦杂交外,其余探针均为特异的。5株结核分支杆菌临床分离株鉴定为结核分支杆菌复合群,19株非结核分支杆菌临床分离株鉴定至种水平。结论 16S-23S rDNA ITS PCR-反向杂交鉴定分支杆菌菌种简便、快速、准确,具有较高应用价值。

中华绒螯蟹颤抖病螺原体分布及16 S-23 S rRNA基因间隔区序列的分析

为了探究中华绒螯蟹颤抖病螺原体(Spiroplasma eriocheiris)在江苏省的分布,以2003年至2009年从江苏省养殖池塘收集的发病中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)为研究对象,利用螺原体体外培养、光电镜检测和16 S-23 S rRNA基因间隔区序列比较等方法进行了系统分析。结果表明,S.eriocheiris是一种广泛分布于江苏省养殖中华绒螯蟹体内的病原微生物,它们不仅在7月底8月初的高温季节引起中华绒螯蟹发病和暴发性死亡,还能在3月和11月等低温季节引起部分中华绒螯蟹的发病和死亡,其严重危害中国江苏省中华绒螯蟹养殖业的健康发展。

16S-23SrDNA间隔区序列寡核苷酸探针对结核患者痰标本的检测

目的 应用结核分枝杆菌特异的寡核苷酸探针杂交检测结核患者痰标本中的结核分枝杆菌 ,以评价其在临床应用中的价值。方法 对生物素标记 5’ -端的一个 2 0bp的寡核苷酸探针的敏感性、特异性的研究 ,并应用该探针对 90例结核患者和 3 0例非结核患者痰标本进行了检测。结果 寡核苷酸探针分别检测基因组DNA、3 5 0bpPCR扩增产物、2 5 0bpPCR扩增产物的敏感性分别为 5 5ng ,0 .5ng ,0 .1ng。探针检测特异性实验表明探针检测基因组DNA、3 5 0bpPCR扩增产物特异性较差 ,检测 2 5 0bpPCR扩增产物则只与结核分枝杆菌杂交。探针检测 90例结核患者痰标本结果表明 :探针杂交检测临床标本基因组DNA、3 5 0bpPCR扩增产物、2 5 0bpPCR扩增产物的阳性率分别为 3 3 %、83 %、80 % ,而扩增产物电泳阳性率为 64 %。寡核苷酸探针与 3 0例非结核患者痰标本基因组DNA及PCR扩增产物杂交则全为阴性。结论 寡核苷酸探针化学发光检测临床标本 2 5 0bpPCR扩增产物 ,能提高结核患者痰标本检测的敏感性与特异性。

利用16S-23S rDNA RFLP及16S rRNA基因序列分析方法对湖北省饭豆(Vigna umbellata L.)根瘤菌系统发育的研究

采用16S-23S rDNA间隔区段(IGS)PCR-RFLP与16S rRNA基因部分序列分析的方法对饭豆根瘤菌进行了遗传多样性及系统发育分析.由16S-23S rDNA IGS PCR-RFLP分析可知,所有菌株在52%的相似性水平上聚在一起,形成了慢生型菌群与快生型菌群这两大菌群.群Ⅰ中,在79%相似性的水平上分为ⅠA与ⅠB两个分支.群Ⅱ中,在62%相似性的水平上分为ⅡA与ⅡB两个分支,分支ⅡA在72%的相似性水平上进一步分为ⅡA1、ⅡA2和ⅡA3三簇;分支ⅡB中的饭豆根瘤菌与标准菌株USDA205T聚在一起,表现的差异并不大.由16SrRNA基因部分序列分析结果可知,供试的4个代表菌株分别位于不同的系统发育分支中.CYR4243与Sinorhizobium fredii的模式菌株USDA205T的序列相似性达到了99.87%.HCY1101与Rhizobium leguminosarum中的三叶草生物型(bv.trifolii)和豌豆生物型(bv.viceae)这两个生物型的参比菌株亲缘关系最近,序列相似性为100%.HCY5202与R.galegae亲缘关系最近,序列相似性为99.86%.CYY3302与Bradyrhizobium elkanii的参比菌株USDA86有最近的亲缘关系,序列相似性近似于100%.

山羊奇异变形杆菌分离鉴定及其16S-23SrRNAISR序列RFLP分析

2012年初,山东菏泽某羊场的羊群发病,从发病羊器官分离到2株病原细菌。对病原细菌进行鉴定,并对其与已知同种异源菌株相似性差异进行分析。从患病山羊内脏器官分离细菌,经形态特征、培养特性、生化试验、血清学试验及致病性试验进行鉴定;再通过设计通用引物扩增16S-23SrRNA ISR(intergenic spacer region)序列,将PCR产物经HinfⅠ单酶切获得3条可视条带,同时对扩增条带中的主带测序并进行系统发育分析。结果表明,分离菌株为奇异变形杆菌;分离菌株同本实验室保存的兔源与鸡源奇异变形杆菌PCR-RFLP结果一致;分离菌株PCR产物同GenBank收录的HI4320株奇异变形杆菌及本实验室保存的兔源与鸡源奇异变形杆菌进行序列比较,分离羊源菌株与兔源菌株相似性为94.8%、与鸡源菌株相似性为96.0%～98.2%,与人源HI4320株相似性为96.9%。研究证实发病羊致病病原为奇异变形杆菌,其与鸡源、兔源和人源奇异变形杆菌的亲缘关系较近。

3株杂色鲍致病菌——副溶血弧菌的16S-23S rDNA间区序列的分析

以细菌的 1 6SrDNA 3′端和 2 3SrDNA 5′端的高度保守区为引物 ,扩增了 3株杂色鲍致病菌—副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的 1 6S 2 3SrDNA间区 ,克隆到pGEM T载体上 ,测序。用BLAST和DNAstar软件对 1 6S 2 3SrDNA间区序列及其内的tRNA基因进行比较分析。结果表明副溶血弧菌ZSU0 0 8和ZSU0 0 9测出的 1 6S 2 3SrDNA间区均有 6条 ,间区类型也相同 ,分别为IGSGLAV 、IGSGLV、IGSAG、IGSIA、IGSG 和IGS0 。其中IGSGLAV最大 ,包含tRNAGlu、tR NALys、tRNAAla和tRNAVal基因 ;IGSGLV包含tRNAGlu、tRNALys和tRNAVal基因 ;IGSAG包含tRNAAla和tRNAGlu基因 ;IGSIA,则为tRNAIle和tRNAAla基因 ;IGSG 仅包含tRNAGlu基因 ;而IGS0 最小 ,未包含任何tRNA。菌株ZSU0 1 0测出的 1 6S 2 3SrDNAIGS序列有 5条 ,除缺少IGSAG 外 ,其余的IGS类型均与ZSU0 0 8和ZSU0 0 9相同。与GenBank内的副溶血弧菌IGS序列比较 ,发现副溶血弧菌所有类型的IGS的tRNA基因两端的非编码区具有较高的种内同源性。 1 6S 2 3SrDNA间区结构的差异为建立一种新的副溶血弧菌检测方法奠定了基础。

16S-23S rDNA间隔区在奶牛乳房炎诊断中的应用

以 16 S- 2 3S r DNA间隔区为扩增靶序列的 PCR技术是近年来发展的细菌分类和鉴定新方法 ,具有快速、敏感和特异性高的优点。作者综述了细菌 16 S- 2 3S r DNA间隔区序列的特性及其在奶牛乳房炎病原诊断中的应用等研究进展。

一株嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila的16S-23S rDNA间区序列分析及应用

根据细菌的16SrDNA3′端和23SrDNA5′端的高度保守区设计引物,扩增了一株中华鳖Trionyxsinensis"红板病"病原菌嗜水气单胞菌的16S-23SrDNA间区,克隆到pGEM＿T载体上,测序。用BLAST和DNAstar软件对16S-23SrDNA间区序列以及其内tRNA基因与已发表的嗜水气单胞菌和近缘种的IGSG序列进行比较分析,设计出对嗜水气单胞菌特异的PCR引物,建立了检测嗜水气单胞菌的PCR方法,进行了特异性、灵敏性检测,并用此方法检测了不同的水样。

Q热立克次体中国株的16S-23SrDNA间区序列分析

用PCR扩增了 7株中国分离株 (七医、新桥、雅安、李、YS 8、YS 9和YH 1 1 )和2株国际参考株 (Henzerling和Grita)的 1 6S 2 3SrDNA基因间区 ,对扩增产物进行了序列分析。结果发现它们仅在少数几个碱基位上有不同。在第 6 0位上 3个云南分离株YS 8、YS 9、YH 1 1和Grita株与Stein等报道的序列 (包括九里、其它国际参考株和一些法国临床分离株 )的碱基序列一致 ,为“C” ;其他 5株为“A” ,此位点的不同可能与适应不同的地理环境相关。另外 ,YS 9株在第 8和 2 0 8位、新桥株在第 43 2位也分别出现缺失 ,可能与适应不同的动物宿主或在实验室传代情况不同有关。

中国布鲁氏菌16s-23s rRNA间隔区多态性研究

目的利用16 s-23 s rRNA间隔区(ITS)的多态性,对中国布鲁氏菌种间或种内生物型进行鉴别,评价ITS作为基因标识物的意义,寻找适合布鲁氏菌分型研究的基因标识物。方法应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析技术,对中国120株布鲁氏菌的ITS进行分析和筛选,测序结果与Genbank中的布鲁氏菌ITS序列进行比较分析。结果对16 s-23 s rRNA间隔区的SSCP结果分析,得到4种不同的带型(ⅠI、I、Ⅲ、Ⅳ),测序序列有3个位点的差异,达到99.87%的一致性。结论中国布鲁氏菌的ITS序列高度保守,具有一定探讨其作为布鲁氏菌属种内分型的基因标识的价值。

以16S-23S rDNA间区序列为目的基因设计PCR引物鉴定多杀巴斯德氏菌(英文)

多杀巴斯德氏菌是养殖动物（鸡，猪，牛等）的重要致病菌．本研究以16S-23SrDNA间区序列为目的基因设计PCR引物鉴定多杀巴斯德氏菌．通过对多杀巴斯德氏菌ITS—IA（含有tDNA-Ile和tDNA-AIa的16S-23SrDNA间区序列）的测序和与GenBank中序列的BLAST，设计筛选了一对特异引物PS—F／PS—R．对引物的特异性和有效性，用PCR方法进行了验证．结果表明：所有的多杀巴斯德氏菌标准菌株和分离菌株都能被检出，而全部39株非多杀巴斯德氏菌都没有扩增出特异性条带．其检测灵敏度能达到10^2CFU／mL．研究结果表明，发展了的PCR鉴定方法是省时的和可靠的，整个过程只需要20h，而传统的鉴定方法需要至少5d的时间．

16s～23s rDNA间隔区序列RFLP分析在分枝杆菌分类鉴定中的应用

目的：通过对分枝杆菌１６ｓ～２３ｓｒＤＮＡ间隔区序列ＤＮＡＰＣＲ扩增和限制性酶切分析，评价其在分枝杆菌分类鉴定中的价值。方法：对２１种分枝杆菌和９种亲缘关系较远的非分枝杆菌和４种亲缘关系较近的非分枝杆菌的１６ｓ－２３ｓｒＤＮＡ间隔区序列ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增并对扩增产物进行限制性内切酶ＨａｅⅢ．ＭｓｐＩ消化反应，分析不同菌种扩增片段及其限制性片段长度多态性的差异。结果：ＰＣＲ扩增结果显示：分枝杆菌一般扩增出１～２带，非分支杆菌一般有１～３条带。８０％的缓慢生长分枝杆菌扩增片段集中在３４０～４００ｂｐ，快速生长分枝杆菌扩增片段集中在４７０～５７５ｂｐ。单从扩增产物的琼脂糖凝胶电泳只能鉴定４２％的受试菌种。酶切结果显示：３种分枝杆菌酶切图谱没有区别，大部分分枝杆菌的酶切图谱彼此不同，而大部分非分枝杆菌不能被ＨａｅⅢ．ＭＳＰⅠ消化。结论：说明１６ｓ～２３ｓｒＤＮＡ间隔区序列ＤＮＡＰＣＲ扩增和限制性片段长度多态性分析是分枝杆菌菌种分类鉴定的一种快速、有效的方法。

常见分枝杆菌种内不同株之间16S rRNA基因和16S-23S rRNA ITS序列分析结果的比较

目的针对常见分枝杆菌不同株对其基因序列进行分析,比较分析结果。方法利用16S rRNA Gene和16S-23S rRNAITS(转录间隔区序列)分析法分别对97株共7种DSMZ/ATCC引进的常见分枝杆菌进行种内不同株之间基因差异性分析,对比两种分型结果的异同。结果 16S rRNA基因可将13株草分枝杆菌分为3个型别,18株偶发分枝杆菌分为6个型别,17株耻垢分枝杆菌分为4个型别,8株戈登分枝杆菌分为3个型别,9株龟分枝杆菌龟亚种分为3个型别,15株堪萨斯分枝杆菌分为2个型别,17株产鼻疽分枝杆菌分为1个型别;而16S-23S rRNA ITS可依次将上述分枝杆菌分为3个、15个、7个、3个、4个、3个、5个型别。结论 16S rRNA Gene分析和16S-23S rRNA ITS分析均是分枝杆菌基因型分析的可靠方法,此外,16S-23SrRNA ITS的种内多态性高于16S rRNA Gene。