犬贾第虫核糖体16sRNA部分序列克隆及测定

目的 获取犬贾第虫核糖体 16sRNA基因序列。方法 从犬贾第虫包囊中 ,快速提取DNA ,并以DNA为模板 ,利用热启动PCR技术扩增出一 6 11bp的预计大小的基因片段 ,纯化回收后 ,与PMD18 T载体连接转化到DH5a大肠杆菌中 ,筛选到阳性克隆经PCR、EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定 ,并用双脱氧链末端终止法测定DNA序列 ,登陆BLAST进行同源性比较和分析。结果 获得了长度为 6 11bp的基因序列 ,并发现与犬贾第虫核糖体的同源性最高达 99%。结论 获得了犬贾第虫核糖体 16sRNA的部分基因序列 ,为研究其在核酸进化领域中的地位和PCR法快速诊断贾第虫病提供了理想的基因材料。

PCR/16sRNA联合核苷酸测序法检测化脓性脑膜炎病原菌的临床价值

目的:探讨PCR/16sRNA联合核苷酸测序法在化脓性脑膜炎病原菌检测中的临床诊断价值。方法:选择2016年4月至2017年2月上海儿童医学中心临床考虑中枢感染的43例化脓性脑膜炎患儿的脑脊液标本,所有患儿标本同时进行培养,并行PCR/16sRNA联合核苷酸测序法检测,记录检测结果,并统计检测方法的灵敏度和特异度,以脑脊液培养检测结果为金标准,对比脑脊液培养和PCR/16sRNA联合核苷酸测序法的灵敏度和特异度。结果:脑脊液培养的灵敏度为21.7%,特异度为100.0%;PCR/16sRNA联合核苷酸测序的灵敏度为69.6%,特异度为95.0%;两者的灵敏度比较差异具统计学意义(P<0.05),而两者特异性比较差异无统计学意义(P>0.05)。PCR/16sRNA联合核苷酸测序可检出脑脊液培养阴性的病原体。结论:PCR/16sRNA联合核苷酸测序具有较高的灵敏度,可检出脑脊液培养阴性的病原体,且受抗菌药物影响小,可为临床早期提供化脓性脑膜炎的病原学依据,降低致死率及致残率。

乙型肝炎病毒感染性疾病患者肠道菌群结构和多样性分析

目的探究乙型肝炎病毒(HBV)感染性疾病患者肠道菌群间的差异性。方法收集2020年2—9月新疆医科大学第一附属医院肝病专科收治的133例肝病患者粪便,包括HBV携带者(HBV组)23例、乙型肝炎肝硬化(LC组)25例、肝细胞癌(HCC组)38例、慢加急性肝衰竭(ACLF组)16例、自身免疫性肝炎(AIH组)13例和原发性胆汁性肝硬化(PBC组)18例。提取粪便样本基因组DNA,特定性引物扩增DNA样本中16S rRNA基因的V3~V4可变区。Usparse软件分析扩增序列,并依据分析结果(相似度≥97%)划分OTU,Silva数据库对OTU进行分类信息标注;QIIME软件进行肠道菌群物种多样性和组间菌群差异性分析。结果6组样本中门水平上丰度前4的菌门依次为Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidota、Actinobacteria,HBV组、LC组、HCC组、ACLF组、AIH组和PBC组样本中4大菌门总占比分布为88.76%、97.22%、96.15%、92.88%、95.91%和93.36%。HBV组和HCC组Actinobacteria丰度显著高于LC组,HBV组Actinobacteriota和其他菌门丰度均显著高于LC组、HCC组和ACLF组,LC组和ACLF组的Actinobacteriota及ACLF组的其他菌门丰度均显著低于PBC组;LC组Bacteroidota丰度显著高于HCC组;HCC组的Firmicutes丰度显著高于HBV组。6组样本肠道菌群丰度依次为HBV组、PBC组、LC组、HCC组、ACLF组、AIH组。HBV组、LC组、HCC组和PBC组组内菌群差异性较大,组间肠道菌群群落结构差异较大,ACLF组和AIH组中肠道菌群群落比较集中,群落结构相似。HBV组物种数明显多于LC组、HCC组和ACLF组,LC组少于低于AIH组和PBC组,HCC组和ACLF组均显著低于PBC组(P<0.05);HBV组Shannon指数明显高于LC组和ACLF组,LC组、HCC组、ACLF组Shannon指数均明显低于PBC组(P<0.05)。结论HBV感染者随着肝损伤病情加重肠道菌群丰度和多样性下降,且HBV感染者肠道菌群丰度和多样性与AIH和PBC患者均均存在明显差异。

华南地区不同污水处理工艺中硝化菌和反硝化菌的群落结构特征与差异

为研究华南地区采用传统AAO工艺和MBR工艺(典型工艺为AAOA-MBR)的城市污水处理厂(净化厂)的菌群结构及其差异,采用16 S rRNA基因扩增子测序技术对11座净化厂的22条生产线进行了菌群结构表征,系统分析了硝化细菌和反硝化细菌的相对丰度及其在不同工艺中的种群特征与差异,并与其他地区的菌群结构进行了综合对比.结果表明,AAOA-MBR工艺中氨氧化细菌(Ammonium oxidizing bacteria,AOB)Nitrosomonas的平均相对丰度为AAO工艺中的2倍;各生产线中亚硝酸盐氧化细菌(Nitrite Oxidizing Bacteria,NOB)Nitrospira的平均相对丰度普遍较高,在采用AAO-MBR工艺的净水厂中,其相对丰度可达到22.22%;反硝化细菌则在AAO工艺中得到较好的富集,如反硝化聚糖菌Ca.Competibacter,其平均相对丰度在AAO工艺中可达到2.04%,远高于采用AAOA-MBR工艺的净水厂.与其他地区相比,华南地区净水厂中AOB丰度较低,NOB丰度较高,反硝化菌的优势种群也存在显著差异.华南地区净水厂中NOB的高丰度对短程硝化-反硝化的实现提出了更高的挑战;反硝化菌群的多样性及差异则进一步强调了不同净水厂需根据各自的反硝化菌群组成优化反硝化碳源投加.

金鱼嗜水气单胞菌的分离鉴定及药敏试验

自病死金鱼肝脏中分离到一株优势菌,对其进行感染试验、培养特性观察、生化特性鉴定及16SrRNA序列分析。试验结果表明,该分离菌株为嗜水气单胞菌,与已报道的嗜水气单胞菌的16S rRNA序列同源性>99.3%。用纸片扩散法进行药敏试验,试验结果显示,该分离株对四环素类、喹诺酮类、磺胺类、头孢呋新、头孢他啶、头孢吡肟等21种药物敏感,对青霉素G、氨苄西林、阿莫西林、头孢氨苄、林可霉素、麦迪霉素耐药。本次金鱼发病是由嗜水气单胞菌感染引起,可选用强力霉素、麦迪霉素、复方新诺明、磺胺甲基异恶唑、阿奇霉素、恩诺沙星、诺氟沙星等多种药物进行防治。

可形成生物膜的禽源产色葡萄球菌的分离鉴定及耐药性研究

从发病鸡关节腔内分离获得1株革兰氏阳性球菌,根据细菌形态、生理生化特性、动物试验,结合16S rRNA基因核苷酸序列测定、系统进化树分析及生物膜半定量检测,确定该分离菌株为可形成生物膜的的产色葡萄球菌,该菌在正常条件下不致病。药物敏感试验和耐药基因检测发现,该菌对磺胺六甲、阿奇霉素、米诺环素等8种药物敏感,对环丙沙星、头孢噻肟钠和复方新诺明中敏,而对万古霉素等13种药物低敏甚至不敏感。检测到该分离菌株包含氨基糖苷类、四环素类和磺胺类的6个耐药基因,说明这是一株多重耐药菌株,推测其耐药性与生物膜的形成有密切关系。

脓毒症小鼠肠道菌群紊乱的研究

目的对比脓毒症组小鼠与正常对照组小鼠的肠道菌群,以明确肠道菌群组成特点。方法将60只BALB/C小鼠随机等分为对照组(CF组)和脓毒症组(SF组)(每组各30只)。SF组小鼠按脂多糖(LPS)10 mg/kg腹腔注射构建脓毒症模型,CF组则予等量生理盐水腹腔注射。术后24、72 h每组小鼠留取粪便标本行16sRNA测序。在72 h同时取盲肠组织做组织学检查。结果LPS干预后72 h小鼠结肠局部黏膜上皮缺失,肠腺结构消失,炎性细胞浸润,上皮细胞肿胀。肠道菌群方面:SF组较CF组小鼠的肠道菌群多样性明显减少。CF组小鼠肠道菌群主要以拟杆菌门和厚壁菌门为主,但SF组小鼠厚壁菌属比例总体呈现减少趋势,变形菌门则表现为增长的趋势。LPS干预后24 h SF组小鼠肠道菌群出现紊乱:粪肠球菌属、大肠杆菌属、弗格森埃希菌属、缓慢葡萄球菌属及不可培养的大肠杆菌属明显增多(P<0.05),梭状芽孢菌属、毛螺科菌属、未培养的梭菌属则明显减少(P<0.05)。LPS干预后72 h SF组小鼠肠道菌群的变化情况:铅黄肠球菌、粪肠球菌、大肠杆菌、费格森埃希菌、金氏拟杆菌、奇异变形杆菌、未培养的埃希菌属和肠球菌明显增多(P<0.05),鼠乳杆菌、未培养的拟杆菌属、约氏乳杆菌则明显减少(P<0.05)。结论脓毒症小鼠可致肠道微生态的紊乱,微生物的多样性减少,潜在致病菌的过度生长,同时炎症作用下肠道屏障的破坏可能为微生物移位创造条件,也可能成为病情进一步发展的重要推动力。

MALDI-TOF MS直接检测清洁中段尿液标本中病原菌的价值

目的探讨基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)对清洁中段尿液标本中细菌的鉴定价值。方法收集300份清洁中段尿液标本,接种于血琼脂平板上,对尿液标本进行离心处理,采用MALDI-TOF MS对离心后的尿沉渣进行鉴定,同时对培养出的单个菌落进行鉴定,并用Vitek 2 Compact及BD phoenixM50全自动微生物分析系统进行鉴定复核。结果300份清洁中段尿液标本中,63份培养鉴定到1种细菌,MALDI-TOF MS的菌株鉴定结果与两种全自动微生物分析系统的细菌鉴定结果的符合率为100.0%;MALDI-TOF MS在以上63份尿沉渣中直接检出25株细菌,检出率为39.7%(25/63);其中大肠埃希菌15株,占60.0%(15/25);肺炎克雷伯菌4株,占16.0%(4/25);粪肠球菌2株,占8.0%(2/25);产气肠杆菌1株,里昂葡萄球菌1株,黏质沙雷菌1株,分别各占4.0%(1/25);20份标本培养出两种细菌,应用MALDI-TOF MS直接在2份尿沉渣中检出2株屎肠球菌,检出率为10.0%(2/20)。结论MALDI-TOF MS鉴定准确率高,可从临床标本直接检测病原菌,节省培养时间,对两种混合菌感染的标本也有一定鉴定能力。

一株具有抗真菌活性的食酸丛毛单胞菌的分离和鉴定

在土壤中分离到一株细菌STRA ,菌块测定法显示该菌可显著抑制玉米小斑病菌和稻恶苗病菌 ,具有抗真菌活性。该菌可以在SFM和LB等多种培养基上生长 ,且菌落生长无明显终止现象 ;革兰氏染色为阴性 ,电镜观察可见 2～ 4根鞭毛。 (G +C) %在 5 9%～ 6 7%范围内。生化指标的检测显示该菌株对所测试的多数糖类不能发酵 ,经BioMerieuxVitek的革兰氏阴性细菌检测试验卡 (GNI)鉴定为食酸丛毛单胞菌 (Delftiaacidovorans)。设计两对简并引物对其 16SRNA进行PCR扩增 ,16SRNA的序列及其相关生物信息学分析结果进一步确证生化鉴定结果。该分离株的抗真菌物质的特性鉴定。

焦磷酸测序法在败血症常见病原体检测中的应用

目的将焦磷酸测序技术应用于败血症常见病原体的检测鉴定。方法根据细菌16S rRNA序列的特点,设计焦磷酸测序用的PCR扩增引物和测序引物,提取败血症常见病原体的基因组DNA,进行焦磷酸测序,分析获得的序列,进行比对,对病原体种类作出判断。结果经焦磷酸测序可以获取有效长度28 bp的序列,使用该测序序列可以有效区分化脓性链球菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷白杆菌、脑膜炎双球菌、沙门氏菌,但不能区分金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌。结论应用焦磷酸测序可以较有效地对败血症常见病原体的种类实现种属水平的区分。

一株嗜盐细菌的16SrRNA基因序列分析

目的:从舟山深海海泥中获得了底泥样品,并从中提取到了一株嗜盐细菌。方法:通过用不同盐浓度的培养基培养,挑取单菌落,反复划线纯化,得到了嗜盐菌的单菌落,通过菌株基因组DNA的提取、菌株的抗性实验、质粒的提取、16SrRNA的PCR扩增及克隆、16SrRNA的全序列分析等手段。结果:得到该菌株的16SrRNA的基因序列。结论:该株嗜盐菌是一株新色盐杆菌。

一株耐盐葡萄球菌的分离与鉴定

目的从盐碱地土壤中分离耐盐耐药细菌。方法采用倍比稀释法从土壤中分离不同性状的细菌,分别对这些细菌进行耐盐性实验,将筛选到耐150g/L NaCl的菌株进行生化实验、药敏实验和16sRNA序列分析。结果16sRNA分析表明从土壤中分离到一株耐盐表皮葡萄球菌,能分解乳糖和蔗糖,可在150g/L NaCl中生长,该菌株对青霉素和苯唑西林耐药。结论该耐盐葡萄球菌株的分离将为耐盐基因的克隆及转基因耐盐菌株的应用奠定基础。

农户自制酸菜中益生潜力乳酸菌的分离鉴定

从农户自制酸菜中分离,鉴定具有益生潜力的优质乳酸菌菌株。根据菌落形态,革兰氏染色和透明圈,从酸菜汁中初步分离到40株乳酸菌菌株,以耐人工胃液为筛选指标,从初筛菌中选择耐酸能力强的乳酸菌,用16sRNA分子生物学方法鉴定菌种。比较筛选菌的耐胆碱能力,产酸性能以及抑菌能力,从中挑选出综合能力最好的菌株。分离得到一株耐酸,耐人工肠液,耐胆碱,产酸能力强,对大肠杆菌,金黄色葡萄球菌和烟曲霉都具有抑制能力的植物乳杆菌。

大黄对脓毒症小鼠早期肠道菌群的影响

目的采用16sRNA测序技术检测大黄对脓毒症小鼠早期肠道菌群的变化情况,分析大黄对脓毒症小鼠的治疗作用机制。方法将45只BALB/C小鼠随机等分为3组,即对照组、脓毒症组、脓毒症大黄干预组。实验前正常饮食、饮水。术前2 d脓毒症大黄干预组按生药量50 mg/kg灌胃给药,每天2次;对照组、脓毒症组给予等量生理盐水灌胃。3组小鼠灌胃给药2 d后,脓毒症组及脓毒症大黄干预组小鼠按LPS 10 mg/kg腹腔注射构建脓毒症模型,对照组予等量生理盐水腹腔注射。建模后24 h取盲肠组织行病理检查以及粪便组织16sRNA检测。结果经大黄干预后,脓毒症小鼠盲肠组织结构的改变得到一定程度的缓解。脓毒症组小鼠厚壁菌属比例明显减少,拟杆菌属相对增多。脓毒症大黄干预组小鼠拟杆菌属、厚壁菌属、弯曲菌属均有减少,而变形菌属明显增多。结论大黄干预后,脓毒症小鼠肠道菌群进一步变化,变形杆菌属相对增多为优势菌群;结合病理结果,考虑大黄对脓毒症小鼠的治疗作用主要是通过保护肠道黏膜屏障而起到保护作用。

基于12S、16S和Cyt b基因部分序列的丽棘蜥系统发育分析

本文测定丽棘蜥12SRNA、16SRNA、Cyt b基因部分序列,并从GenBank中下载15种有鳞目动物的同源序列,以鳄目的2个种(Alligator sinensis和Cairman crocodilus)作为外群,构建MP、NJ和ML分子系统树,探讨它们的系统发育关系。MP、NJ和ML分子系统树聚类的结果显示:蛇蜥亚目、壁虎亚目、蚓蜥亚目、石龙子亚目和鬣蜥亚目能够完全分开,蛇亚目和蜥蜴亚目在有鳞目中为姐妹支关系。

奶牛隐性乳房炎大肠杆菌16S rRNA序列分析

以笔者所在实验室提供,从新鲜奶样中初步分离并通过生理生化鉴定的大肠杆菌为研究对象,设计一对特异性引物,PCR技术检测分离的大肠杆菌。结果表明,扩增的16S rRNA序列大小为1 419 bp,与GenBank上发表的大肠杆菌16S rRNA序列核苷酸同源性为96%,从分子水平上确定分离的菌为大肠杆菌。这为奶牛隐性乳房炎的分子生物学鉴定奠定了基础。

高盐度废水处理中优势耐盐菌鉴定与生长特性研究

以海水比例为50%的模拟水产品加工废水为研究对象,从A/O工艺培养驯化出的耐盐活性污泥中分离出4株优势耐盐菌,并对其形态、生理生化特征和16sRNA序列同源性进行分析,试验结果表明:nyj1和nyj3同为Bacillus,nyj2为Arthrobacter,nyj4为Alcaligenes.在温度为30℃,pH为7.5的试验条件下,4株细菌在海水比例为30%和50%时的比生长速率和世代时间差距很小,在70%海水比例下生长相对缓慢,比生长速率最小,世代时间最长.这一结论对指导高盐度废水处理工程实践具有重要理论意义.

肠道菌群与结直肠癌进展关系的临床研究探讨

目的:探讨结直肠癌不同进展过程中患者肠道的优势菌群以及对结直肠癌进展的影响。方法:回顾性分析2020年1月至2021年5月于潍坊医学院附属医院就诊的20例结直肠癌患者、20例腺瘤性息肉患者和20例健康受试者,分别设为C组、A组和N组,分别收集粪便以及肿瘤组织、息肉组织及肠壁组织。利用16sRNA技术对收集的粪便进行高通量测序,比较微生物的丰度与多样性,并利用免疫组织化学法检测肿瘤组织、息肉组织以及肠壁组织白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)的表达水平。结果:稀释性曲线显示所有样本包含的OTU数目不同;采用α多样性、β多样性、PCoA等分析显示:不同样本间及组间菌群的丰度及多样性有显著性差异。LEfSe分析显示差异最显著的菌为C组Prevotellaceae、A组Enterobacteriaceae、Erysipelotrichaceae和N组Ruminococcaceae、Bifidobacteriaceae。免疫组织化学结果显示IL-6在C组中的阳性率高于A组和N组。结论:在C组、A组与N组中,每个样本的菌群的丰度与多样性并不相同,各组具有明显不同的群落结构,呈现出组内样本差异较小,组间样本差异较大的现象(P<0.05)。结直肠癌可能与Prevotellaceae有关,而腺瘤性息肉可能与Enterobacteriaceae、Erysipelotrichaceae有关。慢性炎症可能通过产生IL-6等炎性因子导致癌前病变,进而进展为结直肠癌。