一株野生细菌的16Sr DNA序列分析与系统发育树的构建

以野生细菌F0 30 3的总DNA为模板 ,采用细菌 16SrDNA的通用引物 ,通过PCR的方法扩增到一条约 1.5Kb的 16SrDNA片段。连接到pGEM -T -easy克隆载体上 ,并用化学法转化E .coliDH5α。用EcoRI对 5个随机挑取的转化子进行的酶切分析表明这 5个转化子皆为阳性。DNA测序表明该PCR扩增到的 16SrDNA片段长为 14 75核苷酸。与GenBank上已提交的16SrDNA进行的比对 (BLAST)表明野生细菌F0 30 3归属于沙雷氏属。由VectorNTISuite 6软件构建的系统发育树表明与深红色沙雷氏细菌 (Serratiarubidaea)亲源关系最近 ,在核苷酸水平有 97.8%的相似性。

草珊瑚耐锌内生细菌分离及其16SrDNA鉴定

通过生理鉴定和分子鉴定的方法,对经2.0 mol·m L^(-1)锌溶液处理后的草珊瑚叶片的内生菌进行分离纯化,培养得到了草珊瑚内生细菌单菌落,对菌落的培养特征、革兰氏染色等生理生化结果,以及提取内生细菌的DNA,并通过PCR得到其16SrDNA序列,通过BLAST比对分析,利用MEGA软件建立发育树等分子鉴定手段,初步推断所分离得到的草珊瑚内生细菌为芽孢杆菌。

16SrDNA方法对新鲜番茄中细菌分布的调查

采用16Sr DNA分子检测方法对番茄中细菌分布进行调查研究,寻找可能存在于番茄中的危害因子。结果表明,5个属的细菌分别是克雷伯菌属,假单胞菌属,泛菌属、肠杆菌属和欧文菌属,其中多数为软腐类细菌,该菌类对番茄本身造成腐烂,同时软腐细菌与人病原菌也存在协同作用。建议加强相关领域的研究并制定控制办法。

基于16S rRNA基因分析乐山市旅游区鸟类粪便微生物多样性

为探究旅游背景下鸟类粪便微生物的群落结构,对乐山市3个旅游区4种鸟类粪便内容物进行16S rRNA基因V3-V4高通量(Illumina MiSeq)测序,20份样品的分析结果表明,在门水平上,拟杆菌门(Bacteroidetes,33.70%)、变形菌门(Proteobacteria,29.86%)、厚壁菌门(Firmicutes,18.43%)为丰富度最高的3个门;在属水平上,相对丰富的属主要为拟杆菌属(Bacteroides,9.79%)、普氏菌9属(Prevotella_9,6.63%)、梭菌属(Fusobacterium,3.50%)。Alpha多样性分析结果表明,Group_C3丰富度和多样性均最高,揭示了乐山市旅游区鸟类粪便微生物中的优势细菌群落组成,为研究旅游地区鸟类肠道微生物多样性提供了新的视角。

重症肌无力患者肠道菌群及其代谢产物的变化

目的探讨重症肌无力(myasthenia gravis,MG)患者肠道菌群及其代谢产物的变化。方法收集MG患者及健康对照者的新鲜粪便标本,使用16S rRNA基因测序测定两组肠道菌群的丰度,并使用气相色谱质谱技术测定代谢产物的水平。收集受试者的临床特征,包括MG定量评分(quantitative MG score,QMGS)、MG日常生活活动能力量表(MG-activities of daily living,MG-ADL)评分、15项MG生活质量量表(MG-specific quality-of-life 15,MGQOL-15)评分、徒手肌力评定量表(manual muscle testing,MMT)评分及乙酰胆碱受体抗体滴度水平,对差异菌群与临床特征的相关性进行分析。结果研究共收集50例MG患者及15名健康对照者。MG组Simpson指数(0.936±0.041)高于对照组(0.888±0.123),即MG组Alpha多样性降低,差异有统计学意义(t=2.349,P=0.022),且两组的微生物表型即Beta多样性存在差异(R=0.966,P=0.001,Adonis)。LEfSe结果提示MG组中志贺氏杆菌、琥珀酸弧菌属、梭杆菌属、瘤胃球菌属富集,而丰度降低的有毛螺菌属、罗氏菌属、脱硫弧菌属、粪球菌属。两组菌群的代谢产物不同,其中MG组有28种上调及71种下调代谢产物。京都基因与基因组百科全书功能聚类分析显示差异代谢产物主要参与代谢途径为氨基酸代谢、核苷酸代谢途径。MG患者肠道微生物61.2%(30/49)的扩增子序列(amplicon sequence variant,ASV)与多种代谢产物相关(P<0.001)。毛螺菌科与患者QMGS(r=-0.496,P<0.001)、MG-ADL评分(r=-0.542,P<0.001)、MG-QOL15评分(r=-0.464,P=0.007)、乙酰胆碱受体抗体滴度(r=-0.315,P=0.026)呈负相关,与MMT评分(r=0.374,P=0.008)呈正相关。结论MG患者肠道菌群存在有益菌丰度下调,有害菌丰度上调的情况,亦存在代谢产物紊乱,且差异ASV与MG肌无力严重程度具有负相关。

基于高通量测序技术的2型糖尿病湿热困脾证患者肠道菌群结构特点与功能差异的研究

目的探讨2型糖尿病湿热困脾证与健康人群肠道菌群结构差异及功能变化。方法选择2019年1月—2020年1月就诊于南京市中医院2型糖尿病湿热困脾证患者30例,另选择同期健康体检者30例作为对照组,通过16Sr DNA高通量测序技术,获得样本的生物学信息,并进行两组间物种及功能注释的分析比较。结果两组共有OTUs为433个,组间比较对照组有83个,湿热困脾证有96个;门水平下,湿热困脾证患者拟杆菌门、变形门的相对丰度显著上升;纲水平下,湿热困脾证患者拟杆菌纲、β-变形菌纲的相对丰度显著上升;目水平下,湿热困脾证患者拟杆菌目、伯克氏菌目、脱硫弧菌目、食物谷菌目的相对丰度较对照组显著上升;科水平下,普氏菌科、产碱菌科、脱硫弧菌科在湿热困脾证患者中的相对丰度上升;属水平下湿热困脾证患者普氏菌属、梭杆菌属、萨特菌属相对丰度较对照组显著上升。基于NMDS、ANOSIM的β多样性分析和以shannon、simpson指数代表的α多样性分析,提示与正常人群相比,湿热困脾证患者肠道菌群多样性存在显著差异(P<0.01,或P<0.05);LEfSe分析可用以筛选湿热困脾证显著高丰度关键标志物为变形菌门、梭杆菌属、拟杆菌门、普雷沃氏菌科、普雷沃菌属等7种菌群;在KEGG数据库富集到湿热困脾证患者涉及的主要代谢通路有9个(P<0.05,或P<0.01),包括丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢、丁酸代谢、三羧酸循环通路、脂肪酸生物合成、叶酸合成、嘌呤代谢、脂多糖生物合成等通路。结论与健康人群相比,2型糖尿病湿热困脾患者在肠道菌群多样性、菌群组成结构上及功能变异等方面存在显著差异,可为2型糖尿病中医辨证提供参考。

三株菲降解细菌的分离、鉴定及降解特性的研究

从石油污染土壤中分离纯化到 3株能以菲为唯一碳源和能源生长的革兰氏阴性杆菌、好氧、不形成芽孢、端生或侧生单根鞭毛 ,分别命名为菌株ZX4、ZX6和EVA17.据部分片段长度的 16SrDNA序列比对分析和生理生化试验结果 ,确认此 3株菌均为鞘氨醇单胞菌属 (Sphingomonas)细菌 ,菌株ZX4为少动鞘氨醇单胞菌 (S .paucimobilis) ,菌株ZX6为溶芳烃鞘氨醇单胞菌 (S .aromaticivorans) ,菌株EVA17尚不能确定 .分析了各菌株在系统发育中的分类地位 .菌株ZX4在 14d内对含量为 10 0 0mg·L-1的菲降解率可达 98 74%.不同底物实验结果表明 ,菌株EVA17可能同时拥有两条菲降解途径 .

产抗菌蛋白芽孢杆菌R21-4的鉴定及其抗菌谱研究

筛选的芽孢杆菌R21-4对某些革兰氏阳性、革兰氏阴性细菌及真菌均有抑制作用,具有较广的抑菌谱,特别是对食品中的常见腐败菌,如蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、产气荚膜杆菌、产气肠杆菌、荧光假单胞菌等均有明显抗菌效果。在对其进行生理生化以及16Sr RNA基因序列测定和聚类分析软件的分析后,鉴定菌株R21-4为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilissp.R21-4,并采用琼脂块法和生长曲线法对其抗菌机理进行了研究。

山药炭疽病菌拮抗放线菌30702菌株的初步鉴定及发酵培养基优化

为了寻求一种高效、环保的防治山药炭疽病菌的新方法,采用对峙平板法从热带药用植物根际土壤中筛选到一株对山药炭疽病菌有较好拮抗作用的放线菌30702。经形态特征培养观察和16Sr RNA基因序列分析鉴定为紫黑链霉菌[Streptomyces violaceoniger]16Sr RNA基因进化分枝的放线菌。通过单因子和多因子正交实验对其发酵培养基进行了优化,通过测定菌体湿重和抑菌圈直径,应用SAS9.3软件进行分析,获得最佳发酵培养基为:可溶性淀粉25 g/L、黄豆粉20 g/L、MgSO_4·7H_2O 0.6 g/L、CaCO_30.2 g/L、初始pH为7.0,优化后菌株发酵产物对山药炭疽病菌抑菌活性提高了31.5%。

高通量测序分析结肠腺瘤患者肠道黏膜菌群的构成变化

目的探讨结直肠癌发展早期肠道菌群的变化规律。方法通过结肠镜活检收集31例结肠腺瘤患者的腺瘤组织以及20例健康志愿者的肠道黏膜,提取基因组DNA,对细菌16SrRNA基因序列V_3~V_4高变区进行PCR扩增,lluminaMiSeq平台上高通量测序分析。结果结肠腺瘤患者的肠道黏膜菌群多样性比健康对照人群显著增高(P<0.01),腺瘤组黏膜菌群结构和健康对照者相比差异显著。门水平上:结肠腺瘤组变形菌门明显增多(P<0.01),厚壁菌门/拟杆菌门比值下降。属水平上:结肠腺瘤组乳球菌属、链球菌属和假单胞菌属增多(P<0.01),而肠球菌属,杆菌属丰度明显下降(P<0.01)。不同病理类型腺瘤比较发现:结肠高级别和低级别上皮内瘤变组肠道黏膜菌群整体结构相似,埃希菌-志贺菌属在高级别上皮内瘤变组呈现上升趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论结肠腺瘤患者肠道菌群多样性和构成与正常健康人存在明显差异,腺瘤患者黏膜菌群结构发生明显失衡,形成了易于肿瘤生长的肠道微生态环境。

锰污染稻田土壤微生物群落结构和遗传多样性研究

采集了湖南省湘潭市锰矿尾渣坝附近受不同程度锰污染的7个水稻田土壤样品,总锰浓度范围为114~4611mg/kg.提取土壤细菌总DNA,用通用引物对其中的16SrDNA进行扩增,然后进行变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis),分析长期受锰污染的水稻田土壤微生物群落结构和遗传多样性变化,存在于污染最严重样点中的细菌种群对锰有较高的耐受性,不同锰污染的样点群落结构发生变化并且有菌种的消亡和新菌种的产生.锰污染直接和间接地改变了水稻田土壤微生物群落结构和遗传多样性.

婴幼儿配方乳粉中双歧杆菌的分子鉴定及标签相符性研究

完成了对我国市场常见益生菌婴幼儿配方乳粉标签标识情况的调查;利用16Sr RNA技术建立了基于双歧杆菌基因组序列的分子鉴定方法,对市场常见的19例益生菌乳粉中分离得到的28株双歧杆菌进行菌株分子鉴定和标签相符性分析,为该类产品的安全监管提供技术参考和建议。

鸡蛋溶血巴斯德菌药敏试验及氨基酸代谢研究

【目的】探讨鸡蛋中溶血性微生物进来源及生物安全性。【方法】采用特异性培养基在鸡蛋中分离一株溶血性微生物,对其进行生化鉴定、16Sr DNA进行测序并聚类分析,采用7类9种抗生素抗性试验对溶血微生物进行药敏试验,对其进行发酵底物蛋白质和游离氨基酸研究。【结果】生化鉴定与16r DNA鉴定分离的溶血性微生为溶血巴斯德菌,药敏试验结果表明氨基糖苷类抗生素对此菌有一定的抑制作用,但青霉素钠、罗红霉素和喹诺酮类抗生素环丙沙星对此菌无抑制效果,底物发酵实验结果为溶血巴斯德菌的代谢对蛋白质总量影响不大,但可升高发酵培养基中部分游离氨基酸的含量。【结论】鸡蛋中存在非常见致病微生物的污染,并且部分抗生素对致病微生物已无抑制作用,鸡蛋中的微生物可以改变底物结构,相关部门应加强对新鲜鸡蛋微生物污染的控制,关注罕见致病菌及条件致病菌引起的危害。

红树林海洋淤泥中放线菌的分离与鉴定

为了解广西北海红树林海洋淤泥中的放线菌资源,采用海水配制高氏培养基分离红树林海洋淤泥中的放线菌样品,从中筛选、分离、提取10株典型放线菌菌株总DNA,用放线菌通用引物对16Sr DNA进行PCR扩增,对获得的扩增结果进行DNA序列测定和对比鉴定。结果表明,10株典型放线菌菌株为2种菌属,其中有8株为链霉菌属(80%),为常见放线菌;有2株为拟诺卡氏菌属(20%),为稀有放线菌。表明,广西北海红树林海洋淤泥蕴含着种类丰富的放线菌。

除臭效果菌株中具有分解纤维素能力菌株的筛选及鉴定

为了筛选同时具有除臭和产纤维素酶能力的菌株,采用滤纸崩解试验初筛筛选到6株具有产纤维素酶能力的菌株,通过用DNS法测定其滤纸酶、内切葡聚糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的酶活进行复筛,最终筛选到具有较高产纤维素酶能力的菌株G2,其酶活力分别为1.737、3.179、1.232 IU/m L。通过形态学观察及16S r DNA分子鉴定,初步确定该菌株为淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),从而为微生物除臭菌剂的制备提供了菌种资源。

鸡蛋污染致病菌分离及鉴定

为了研究污染鸡蛋的致病菌,试验采用微生物分离纯化在鸡蛋表面得到4株菌,用形态学观察和生理生化初步判定为芽孢杆菌和葡萄球菌,再结合16Sr RNA分子方法对4株菌进行分类分析,先用PCR对目的菌进行基因扩增,经克隆及质粒测序,再登录NCBI中Gen Bank数据库进行相似性分析。结果表明:1号菌为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus GXBC-1,2号和3号菌为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus NC7401,4号菌为金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus。这些菌是食源性致病菌,致病性强,传染率高,对食品安全风险大。

寡核苷酸管芯片技术检测和鉴别我国不同组植原体

[目的]不同组植原体检测和鉴别的特异性探针已有报道,为了筛选出适合于我国不同组植原体检测和鉴别的特异性探针,建立管芯片检测和鉴别植原体技术,并对我国发生的疑似植原体病害进行鉴别。[方法]通过PCR扩增结合管芯片杂交技术,对收集到的15种植原体侵染的植物样品及其健康对照进行检测和鉴别。[结果]建立了管芯片检测和鉴别植原体技术体系。15种病害样品中,13种获得显著的阳性杂交信号,并且所有的健康对照都呈现为阴性。13种植原体病害依16Sr DNA直接测序可分为16SrⅠ、Ⅱ、Ⅴ、XIX四组植原体。在所有探针中,植原体的通用探针(Pp-502)可以检测到所有确定的植原体样品。16SrⅠ组特异性探针(PpⅠ-465)可以确定16SrⅠ组的泡桐丛枝、苦楝丛枝、桑树萎缩和莴苣黄化4种植原体样品。16Sr II组特异性探针(PpⅡ-629)仅可以确定16Sr II组的花生丛枝、甘薯丛枝和臭矢菜丛枝3种植原体样品。但16Sr V组的枣疯病、樱桃致死黄化和重阳木丛枝及16Sr XIX组的板栗黄化皱缩植原体与其他组专化性探针皆有明显的交叉杂交信号。相比于PCR扩增的凝胶电泳检测,管芯片检测的灵敏度提高了1 000倍。对疑似植原体病害的诊断结果显示河南濮阳的红花槐丛枝的病原应为16Sr V组植原体,福建福州的长春花黄化丛枝应为16SrⅠ组植原体;而北京戒台寺牡丹黄化皱叶和内蒙古包头柳树丛枝未出现任何植原体专化的杂交信号。[结论]管芯片杂交技术作为一种检测和鉴别植原体的方法,可应用于我国植原体病害调查和诊断,并为植原体的鉴别和分类提供可靠的依据。

紫花针茅内生细菌的分离与鉴定

从东祁连山高寒草地采集优势牧草紫花针茅并分离其内生细菌,以辣椒立枯丝核病菌、油菜菌核病菌、番茄早疫病菌、番茄灰霉病菌、玉米大斑病菌、小麦离蠕孢、甜瓜枯萎病菌和玉米小斑病菌8种植物病原真菌为指示菌,筛选拮抗菌,用阿须贝无氮培养基和PKO培养基筛选固氮菌和溶磷菌,采用传统生理生化测定法和16S rDNA基因序列同源性分析对筛选出的内生细菌进行鉴定。结果从紫花针茅分离到6株内生细菌,其中,菌株ZH4和ZH6对辣椒立枯丝核病菌生长有抑制作用,平板对峙时的抑菌带宽分别为5 mm和4 mm;没有分离到固氮菌和溶磷菌。ZH4和ZH6菌体均为杆状,革兰氏阳性,产芽孢,16S rDNA序列在GenBank中登录号分别为EU236750和EU236752,结合生理生化特征及16S rDNA基因序列同源性分析,鉴定ZH4和ZH6均为蜡状芽孢杆菌。

血液透析和腹膜透析对终末期肾脏病患者肠道菌群的影响

目的探讨血液透析和腹膜透析对终末期肾脏病(ESRD)患者肠道菌群的影响。方法选择健康对照者19名(健康对照组)、未透析的ESRD患者38例(未透析组)、持续腹膜透析的ESRD患者25例(PD组)、持续血液透析的ESRD患者27例(HD组),使用16S rDNA测序分析研究对象的粪便样品中肠道微生物群的组成和功能。结果与健康对照组比较,未透析的ESRD患者α多样性中的Simpson指数升高(P<0.05),未透析组、PD组、HD患者肠道菌群的α多样性Observed species指数、Chao1指数和Simpson指数比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。β多样性分析显示4组之间物种组成结构比较差异有统计学意义(P均<0.05)。健康对照组及未透析组肠道菌群以拟杆菌门和厚壁菌门为主。与未透析组相比,HD组肠道菌群拟杆菌门减少(P<0.01)。4组研究对象的肠道菌群在科水平分类中比较差异有统计学意义的菌科有8个(P均<0.05),其中PD组和HD组肠道中普雷沃特尔菌科比例均较低。与未透析组比较,HD组肠道中毛螺菌科比例增加、脱硫弧菌科和紫单胞菌科比例降低;HD组肠道中理研菌科减少(P均<0.05)。与健康对照组相比,未透析组肠道中紫单胞菌科比例增加(P<0.05)。丹毒丝菌科比例在未透析组、PD组、HD组肠道中均有所增加,产碱菌科和韦荣氏菌科比例在健康对照组、未透析组、PD组肠道中相近,但在HD组肠道中降低(P均<0.05)。结论血液透析和腹膜透析治疗未明显破坏肠道菌群的多样性,但改变了ESRD患者肠道菌群的种类和数量。