16SrDNA结合显色法芯片技术鉴定分枝杆菌的方法学研究

目的建立16SrDNA结合显色法芯片技术(玻璃芯片转尼龙膜显色法)鉴定分枝杆菌的方法。方法利用GenBank中细菌16SrDNA保守区序列,设计两对分枝杆菌属特异性通用引物,采用双重PCR法同时扩增16SrDNA的2个不同片段;根据已知16种分枝杆菌的16SrDNA序列,设计合成对应的特异性寡核苷酸探针。先用通用引物PCR扩增所有标准菌株DNA,PCR产物分别与16种分枝杆菌探针的玻璃芯片杂交,通过尼龙膜显色进行分析。结果应用显色法芯片技术分析16种分枝杆菌标准菌株和5种非分枝杆菌菌株,对其双重PCR、杂交、洗涤条件进行优化。确定双重PCR最佳退火温度为52℃,在该温度下除5株非分枝杆菌外均产生2条DNA片段,大小分别为272～280bp和183～192bp;杂交温度32℃、2×SSC洗涤5min、0.2×SSC洗涤1min,16种分枝杆菌的杂交效果最好,特异性达100%。结论用显色芯片法检测16SrDNA,可准确鉴别16种分枝杆菌。

ftsZ基因和16SrDNA特异引物检测栗瘿蜂体内Wolbachia感染研究

应用Wolbachia的ftsZ基因和16SrDNA特异引物,通过PCR扩增法检测栗瘿蜂Dryocosmus kuriphilus(Yasumastu)6个地理种群(河北保定、山东泰安、甘肃陇南、湖南株洲、湖南怀化、福建福州)体内Wolbachia感染情况.结果表明:野外采集的6个地理种群全为雌性个体;湖南株洲、福建福州两个地理种群体内有Wolbachia感染,感染率分别为25.0%和87.9%,其余4个地理种群未发现Wolbachia的感染.

利用16SrDNA快速鉴定自制酸奶中5种双歧杆菌的研究

文章建立了自制酸奶中5种双歧杆菌的鉴定方法,评价该方法鉴定双歧杆菌的实用性和准确性。将酸奶中5种双歧杆菌分离纯化培养后,用PCR扩增双歧杆菌的16SrDNA片段,将扩增产物纯化后,使用ABI PRISM 310型基因测序仪进行测序,随后使用ABI自带菌库和互联网菌库等进行序列比对,做出相似性分析,鉴定出5株菌分别为长双歧杆菌、短双歧杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和青春双歧杆菌。该方法可以快速准确地鉴定出酸奶中的双歧杆菌类型。

一种国产全自动微生物质谱检测系统性能评价

目的对国产全自动微生物质谱检测系统的临床常见病原菌鉴定能力进行评价。方法收集该院2021年3-5月来自临床非重复菌株302株。采用CMI-3800全自动微生物质谱检测系统(CMI-3800 MS)和VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定仪(VITEK 2 Compact)对病原菌进行鉴定,结果不一致的菌株采用16SrDNA基因测序予以确认。结果CMI-3800 MS鉴定到属水平有297株(98.34%),鉴定到种水平有288株(95.36%);VITEK 2 Compact鉴定到属水平有296株(98.01%),鉴定到种水平有277株(91.72%)。两种检测方法鉴定属一致的为296株(98.01%),种一致的为277株(91.72%);在种不一致的25株中取18株采用16SrDNA测序鉴定。结果显示,CMI-3800 MS有12株标本在种水平鉴定与16SrDNA基因测序结果完全一致,4株标本属水平一致,其余2株种属均不一致;VITEK 2 Compact有13株标本在属水平鉴定与16SrDNA基因测序的结果一致,4株种属均不一致,有1株未能鉴定出来。结论CMI-3800 MS与VITEK 2 Compact对临床常见病原菌的鉴定结果较一致,但前者通量大、重复性好、操作简便,且在时间和经济成本上明显优于后者,符合对临床微生物鉴定的要求。

分子生态学方法对油藏细菌群落结构分析的比较

目前对油藏细菌群落结构分析方法繁多,为得到准确全面的群落分析结果,必须选取合适的方法。群落分析方法的优劣进行比较分析,选取从新疆陆梁油田注水井筛出的11株单菌,测定其16srDNA序列,制成包含7个菌属、9个菌种的混合菌液。应用基于PCR扩增的三种分子生态技术DGGE、T-RFLP、建立16SrDNA文库比较和分析了混合菌液细菌多样性。使用PCR-DGGE方法时发现,DGGE方法可灵敏地检测到序列1 bp的变化,能将不同菌株分开,但该方法经过切胶测序后的的目标序列较短,信息量不大且有时有一定误差,较适合用于定性对比;而用于菌群结构的分析时应结合其他方法。T-RFLP法可区分大部分菌属,但数据库不够完整,不能确定细菌群落组成;因此也不适合单独用在细菌群落检测中,可用作多个样品种群多样性的对比或结合其他方法对样品进行系统透彻解析。建立16srDNA克隆文库法成功鉴定到7个菌属8个菌种16SrDNA序列,更适用于油藏细菌群落结构的分析。

土壤解磷菌RQ3-01的筛选及初步鉴定

为从土壤中筛选出具有解磷能力的菌株,采用透明圈法筛选菌株,采用钼锑抗比色法测定可溶性磷含量,并对菌株进行形态学,生理生化和分子生物学鉴定。结果表明,采用无机磷培养基初筛出9株具有解无机磷能力的菌株,透明圈法复筛表明,RQ3-0菌株解无机磷能力最强,D/d值为1.78;采用钼锑抗比色法测出RQ3-01菌株的解无机磷和有机磷能力分别达到22.313 mg·L^(-1)和20.266 mg·L^(-1),通过形态学鉴定和生理生化鉴定显示,RQ3-01菌株是革兰氏阴性菌,不产芽孢,呈杆状,吖啶橙染色呈黄绿色荧光,氧化酶实验呈阳性。经16SrDNA的扩增与测序检测,RQ3-01菌株的碱基对为1391 bp,核糖体数据库比对显示,RQ3-01菌株与荧光假单胞菌相似100%。所以,从土壤中筛选出来的具有解无机磷能力的RQ3-01菌株是荧光假单胞菌。

江西某铀矿堆浸尾渣微生物群落演替研究

应用16Sr DNA基因文库技术研究了江西某铀矿堆浸尾渣冬季到次年夏季微生物群落演替情况。结果表面:冬季Acidimicrobium ferrooxidans占48.5%,Leptospirillum ferriphilum占17.5%,Xanthomonas albilineans占11.3%,Mycobacterium sp占7.2%,其它异养菌占15.5%。夏季Leptospirillum ferriphilum占87.40%,Nitrobacter winogradskyi占1%,其它异养菌占11.6%,Acidimicrobium ferrooxidans未检出。

福鼎海域坛紫菜叶状体体表外生细菌的组成和数量分析

从采集自福鼎敏灶湾和硖门湾海域的健康坛紫菜（Porphyra haitanensis）叶状体体表分离、纯化到26株外生细菌．根据细菌菌落特征、菌体形态和16SrDNA基因序列分析相结合的方法进行鉴定，将其确认为6种不同的菌属，分别是假交替单胞菌属（Pseudoaheromonas）、Aquimarinas属、交替单胞菌属（Aheromonas）、黄杆菌属（Flavobacteriums）、弧菌属（Vibrio）和嗜琼胶菌属（Agarivorans）．2个海湾坛紫菜叶状体体表外生菌群数量稳定且差别不大，外生细菌菌属组成基本相同，个别菌属稍有差异，优势菌属为假交替单胞菌属和Aquimarinas属，常见菌属为交替单胞菌属和黄杆菌属，少见菌属为弧菌属．敏灶湾坛紫菜体表外生菌群数量为（5．7～6．5）×10^4cfu／g，外生细菌中各菌属所占比例为：假交替单胞菌属占38．5％，Aquimarinas属占52．8％，交替单胞菌属占13．9％，黄杆菌属占11．5％，弧菌属占3．3％．硖门湾坛紫菜体表外生菌群数量为（6．4～7．6）×10^4cfu／g，外生细菌中各菌属所占比例为：假交替单胞菌属占37．3％，Aquimarinas属占32．0％，交替单胞菌属占14．0％，黄杆菌属占12．7％，弧菌属占2．7％，嗜琼胶菌属占1．3％．优势和常见菌属菌株对健康坛紫菜叶状体进行感染，发现这些菌株对坛紫菜叶状体无致病力，叶状体生长无异常．这些可为坛紫菜微生物学研究提供基础资料．

山西运城盐湖嗜盐细菌的系统发育与种群多样性

为嗜盐微生物资源的保护、开发和利用提供理论依据,采用分子生物学方法对运城盐湖沉积水土样品的嗜盐细菌进行分离,并采用克隆文库法构建嗜盐菌可培养文库和未培养文库,对2个不同文库环境样品中细菌群落进行系统发育分析及其多样性、丰富度和优势度研究。结果表明:可培养文库的主要类群为厚壁菌门(Firmicutes,55%)和变形菌门(Proteobacteria,45%),未培养文库的主要类群为变形菌门(Proteobacteria,43%)、厚壁菌门(Firmicutes,28%)和拟杆菌门(Bacteroidetes,10%)等。可培养文库和未培养文库的Shannon多样性指数(H′)分别为2.63和4.83,二者的多样性虽都比较丰富,但未培养文库的多样性高于可培养文库,表明其物种更为丰富。

烟草根际促生菌(PGPR)的筛选、鉴定及促生机理研究

筛选并鉴定了贵州烟区烟草根际促生菌(PGPR)菌株。测定PGPR产激素能力、定殖能力以及对烟草苗期促生作用,以具备多项促生能力为筛选标准,确定目标PGPR,再通过16S r DNA、平板对峙以及PCR技术对目标PGPR进行属鉴定、抗病能力测定。通过筛选获得的7株目标PGPR均能产生脱落酸、细胞分裂素、赤霉素和生长素。烟苗盆栽试验表明7株PGPR均具有促生效果,其中LX-7处理的烟苗鲜重和根系活力最大;大田移栽30d后,LX-7根际定殖数量可维持10~7cfu/g根,显著高于其它菌株;抑菌试验证实LX-4、LX-5和LX-7具有广谱抗菌作用。综合考量,LX-4、LX-5和LX-7具有显著的促生效果,经16S rDNA鉴定分别为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌。

跨界融合子Fhhh降解PTA废水mnp基因转录研究

报道Fhhh的遗传稳定性 ,及其降解精对苯二甲酸 (PTA)废水过程中基因转录的研究结果 .聚合酶链式反应PCR的测定结果是 ,Fhhh同时含有mnp(来自黄孢原毛平革真菌 )、FL0 1(来自酿酒酵母真菌 )和 16SrDNA(来自土著细菌 )的 3个亲株的基因DNA片断 .表明Fhhh具有分子遗传稳定性 .反转录一扩增 (RT_PCR)的测定表明 ,Fhhh和黄孢原毛平革菌在降解PTA废水过程中 ,在Mn2 +、Cu2 +、Zn2 +、Se4 +4种金属元素优化水平的条件下 ,mnp基因均可转录 .研究结果为高效处理PTA废水 。

应用通用引物量化检测鲜肉及其制品中羊源性成分

分别以牛、羊、猪、鸡、鸭、马线粒体细胞色素b基因为研究对象,设计羊源性成分特异性引物和探针,同时结合实时荧光定量PCR技术,引入16SrDNA内参基因校正羊种属特异性基因测定方法,建立快速、高通量的鲜肉及鲜肉制品中羊源性成分确证方法,实现科学准确的食品掺假量化判定技术体系。通过特异性、通用性及模拟混合样品的检测,对所建立方法进行验证。结果表明:建立的羊源性成分含量测定方法具有良好的特异性和通用性,且通过标准曲线的构建,呈现良好的线性关系均达0.996以上;通过羊种属特异性基因与16SrDNA内参基因Quantity值及校正系数,可以计算出样品中所含羊源性成份的质量百分比含量,经模拟混合样品的检测,回收率平均值到达96.25%,说明量化研究结果具有较高的准确性。

眼表菌群与眼表疾病关系的研究进展

眼表菌群是定植于眼表的各种微生物群落,以细菌为主。在正常情况下,眼表菌群与人体眼表组织的细胞和平共生,维持眼表的稳态,共同保证眼表的健康。但在环境改变或免疫力低下的情况下,眼表菌群会发生变化,与眼部疾病的产生与发展关系密切,对人类的健康造成巨大的危害。随着组学研究的不断发展,我们对眼表菌群有了新的认识,为眼表疾病的发病机制、治疗开辟了新的思路,同时也提出了新的挑战。本文对国内外眼表菌群与疾病关系进行综述,为眼表疾病的发生、发展以及治疗提供参考。

基于高通量测序的偏执型精神分裂症患者肠道菌群的差异性研究

目的探究偏执型精神分裂症患者肠道菌群的差异及与临床症状的相关性。方法以2019年2月至2020年4月收治的27例符合入选标准的偏执型精神分裂症患者设为观察组,选取同期31例符合入选标准的健康体检者设为对照组,收集两组患者清晨空腹状态下中段粪便标本,采用16SrDNA基因测序技术,比较两组肠道菌群的差异以及与临床症状的相关性。结果通过对两组肠道特定菌群水平进行统计,发现观察组体内柯林斯菌属、小杆菌属、脱硫弧菌属、嗜胆菌属、粪厌氧棒杆菌及毛螺菌属的丰度与对照组比较差异均具有统计学意义,其中柯林斯菌属、小杆菌属、脱硫弧菌属和嗜胆菌属表达值显著高于对照组(P<0.05);粪厌氧棒杆菌、毛螺菌属表达值显著低于对照组(P<0.05)。观察组的柯林斯菌属、粪厌氧棒杆菌、毛螺菌属、小杆菌属、脱硫弧菌属、嗜胆菌属与PANSS阳性分、阴性分、一般病理分及总分之间的相关性进行分析,发现嗜胆菌属和阳性分、一般病理分和总分存在正相关,差异具有统计学意义(P=0.045、P=0.043和P=0.035),说明阳性症状和一般精神症状与其可能存在一定关系。结论在偏执型精神分裂症患者与健康人中,肠道菌群的构成存在显著差异,并且与临床症状存在一定的相关性,可能为解析偏执型精神分裂症的发病机制提供新的思考。

汉防己甲素治疗后煤工尘肺患者肠道菌群的变化特征

[背景]尘肺病是目前我国广泛存在的职业病,作为肺部疾病的一种,其病理损害主要为肺部不可逆的纤维化改变。目前有多项研究显示,煤工尘肺等肺部疾病的发生、发展与肠道菌群有密切的联系。[目的]基于16SrDNA高通量测序结果,观察煤工尘肺患者的肠道菌群特征及服用汉防己甲素(粉防己碱)治疗后肠道菌群的变化。[方法]于2023年4—7月,纳入就诊于应急总医院职业病科门诊共80例煤工尘肺患者。所有患者均服用汉防己甲素片治疗4周。同期设健康对照24例。汉防己甲素片治疗前为A组,治疗后为B组,健康人群为C组。治疗前后分别收集粪便样本,利用16SrDNA高通量测序技术基于V3-V4平台,检测患者治疗后的肠道菌群变化。[结果]治疗前A组、治疗后B组与健康人群C组对比发现门水平及属水平优势菌群相同,治疗后B组与健康人群C组中拟杆菌门、双歧杆菌属、拟杆菌属及粪杆菌属相对丰度均高于治疗前A组,放线菌门、布劳特氏菌属及罗姆布次菌属相对丰度均低于治疗前A组(均P<0.05)。健康人群C组在梭菌属、巨单胞菌属及乳杆菌属的相对丰度上均低于治疗前A组与治疗后B组,差异均有统计学意义(P<0.05)。Alpha多样性分析示:A组Chao1指数高于C组(P<0.01)。与治疗前A组相比:治疗后B组Shannon指数均升高,壹期患者中Simpson指数升高差异均有统计学意义(P<0.05),Chao1指数差异无统计学意义(P>0.05);贰期和叁期患者Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数值差异均无统计学意义(P>0.05)。Beta多样性分析显示:煤工尘肺A组与健康人群C组间菌群结构差异有统计学意义(P<0.05);不同分期治疗前后菌群结构差异均有统计学意义(P<0.05)。偏正交最小二乘法分析(PLS-DA)显示A组与C组、治疗前后A组与B组存在明显的组间差异。LEfSe分析显示治疗后在壹期、贰期和叁期中发现对差异贡献显著标志物基本一致,主要为拟杆菌门及其下属菌群、厚壁菌纲、月形单孢菌目及粪杆菌属。[结论]煤工尘肺患者与健康人群的菌群分布存在差异,汉防己甲素片治疗后肠道菌群的结构和相对丰度改变,有益菌群数量增加。

辽宁省空调冷却水中非嗜肺军团菌基因分型与毒力初探

目的了解辽宁省集中空调冷却水中检出的非嗜肺军团菌基因分型,并对其携带的毒力基因情况进行调查。方法采用16SrDNA和mip基因作为引物对2013～2017年辽宁省各大公共场所空调冷却水中分离到的9株非嗜肺军团菌基因分型鉴定,同时对它们分泌的系统毒力岛基因组进行了检测。结果检出4株茴芹军团菌(L.anisa),2株吉斯特军团菌(L.geestiana),1株沃斯利军团菌(L.worsleiensis),2株红光军团菌(L.rubrilucens);9株非嗜肺军团菌中有8株携PAI毒力基因。结论辽宁省公共环境集中空调冷却系统中存在非嗜肺军团菌,以茴芹军团菌居多,且多数分离菌株携带毒力基因,是可致病性病源菌。

产胆酸盐水解酶乳酸菌的鉴定及其生物信息分析

对初步筛选得到的胆酸盐水解酶活性高的2株乳杆菌进行了16SrDNA鉴定,结果表明,KLDS 1.0317和KLDS 1.0386均为植物乳杆菌。以牛磺脱氧胆酸盐和甘氨脱氧胆酸盐为底物,对两株植物乳杆菌所产BSH的比酶活进行了测定,试验证明了BSH具有底物特异性,且两株菌降解甘氨结合胆盐的能力强于牛磺结合胆盐;利用PCR技术克隆出胆酸盐水解酶基因,翻译成相应的氨基酸,并利用生物分析手段对bsh 1基因以及其预测氨基酸序列进行了对比分析,结果表明,两株植物乳杆菌的bsh 1基因非常保守,且预测的氨基酸序列的相似性非常高,不低于98%。