福建省稻田土壤细菌群落的16S rDNA-PCR-DGGE分析

用不依赖细菌培养的16S rDNA-PCR-DGGE方法对福建省6个不同地区12个取样点的稻田土壤进行细菌群落结构分析。对12份样品直接提取其总DNA,用F341GC/R534引物扩增16S rDNA基因的V3可变区,结合DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)技术分析样品细菌群落组成。结果表明,福建省不同地区的稻田土壤之间细菌群落结构存在较大差异,大体上可分为闽东、闽南、闽北、闽西4个大类。同一地区的根际土和表土样品之间也存在差异,但差异相对较低,其中龙岩根际土和表土细菌群落结构相似性最大,永泰差异性最大。回收了DGGE图谱中11个条带,测序结果经过Blast比对表明其中10个条带代表的细菌是不可培养的,显示了DGGE技术的优越性。

34株副溶血弧菌16S-23SrDNA间区多态性DGGE分析

采用PCR-变性梯度凝胶电泳技术(PCR-DGGE)分析比较了34株分离于环境和水产养殖动物体内的副溶血弧菌及标准株16S-23S rDNA间区(Intergenic Spacer Region,ISR)的多态性和亲缘关系。结果表明,34株副溶血弧菌的ISR经PCR-DGGE电泳后均能分离出4―10条条带,共计产生15个多态性位点。所有菌株聚为H、I、J、K四大簇,株间遗传差异最大为株A18和A25,遗传距离达到0.4。ISR PCR-DGGE方法为副溶血弧菌基因分型提供了一种新的方法。

16S rDNA和PCR-DGGE技术分析水晶肘花胀袋的微生物原因

为了探索真空包装肘花胀袋的原因,应用16S rDNA序列分析和聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术对从正常和胀袋的肘花产品中分离纯化到的14和18株菌进行种类比较分析。结果表明,胀袋组中含有对照组没有的细菌种类,这些菌株主要是芽孢杆菌(包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis))以及嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)和该属的另一株菌Stenotrophomonas pavanii);这些菌株主要是包括产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)在内的梭状芽孢杆菌(Clostridium sp.)和假单胞菌(Pseudomonassp.),推断芽孢杆菌属和梭状芽孢杆菌属细菌的存在可能是引起产品胀袋从而使产品变质的主要原因。

基于16SrDNA序列分析及特异PCR鉴定DVS中未知乳杆菌

目的:探讨EZAL-MY96直投式酸奶发酵剂(DVS)中未知乳杆菌的分子生物学鉴定方法。方法:采用显微观察初步鉴定,利用16SrDNA序列分析方法进一步鉴定,利用NCBI中BLAST数据库对测序结果进行比对,构建系统发育树进行分析,并对菌种进行特异PCR分析。结果:最终确定该未知乳杆菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.Bulgaricus)。结论:基于16SrDNA序列分析及特异PCR结合的方法可以快速、准确地的鉴定出未知乳杆菌。

16srDNAPCR鉴定术后龟分支杆菌脓肿亚种的爆发感染

采用分子生物学技术 ,从基因水平上诊断此次术后爆发感染的致病菌。根据分支杆菌的 16srDNA序列 ,设计合成一对引物 ,采用聚合酶链反应技术 ,并以结核分支杆菌、龟分支杆菌龟亚种和偶然分支杆菌做对照 ,对5 3株龟分支杆菌脓肿亚种临床分离株进行PCR扩增。在此基础上 ,采用 16srDNAPCR扩增体系检测 2 5 9份临床标本。结果 5 3株龟分支杆菌脓肿亚种临床分离株均被扩增出一条特异的 5 84bpDNA带。 2 5 9份临床标本 ,PCR扩增阳性率为 62 9%。

16SrDNAPCR法对实验用小鼠细菌感染的检测试验

通过合成细菌 16 Sr DNA高度保守区引物 ,采用 PCR法对 16种标准菌株 DNA和小鼠的基因组 DNA、人基因组 DNA、乙肝病毒、巨细胞病毒进行扩增。 PCR法结果表明 :细菌具有371bp扩增产物 ,与小鼠基因组 DNA、人基因组 DNA、巨细胞病毒和乙肝病毒无交叉阳性反应。PCR法最低能检测 10 0 fg大肠埃希菌 DNA。检测实验动物细菌感染 ,具有快速、特异性和敏感性高的特点。本研究证实 :16 Sr DNA PCR法能够快速 ,特异地检测实验动物常见细菌感染 ,具敏感性高。

基于PCR-DGGE和16S rDNA克隆技术研究土壤细菌多样性的实验技术

PCR-DGGE是测定土壤微生物多样性常用的技术手段之一,但是提供的微生物多样性信息不够完整,如果与16S rDNA克隆技术相结合,微生物多样性信息更加丰富.PCR-DGGE和16S rDNA克隆实验技术复杂,许多新手没有成熟可靠的经验可借鉴.以土壤细菌多样性研究方法为例,分别从DNA提取与纯化、PCR扩增、DGGE、胶片染色技巧以及16S rDNA克隆技术等环节进行技术体系构建,可供利用该技术的研究人员参考.

螺旋粉虱成虫体内细菌群落多样性的PCR-DGGE和16S rRNA文库序列分析

为了解螺旋粉虱Aleurodicus dispersus体内细菌多样性和主要优势菌群结构,用PCR-DGGE和16S rRNA文库对采自于海南省番石榴上螺旋粉虱雌、雄成虫体内的细菌群落进行了分析。用PCR扩增体内细菌16S rRNA基因,构建雌、雄虫克隆文库;再用限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)方法从文库中筛选不同16S rRNA基因图谱,根据图谱对克隆子进行分型。从螺旋粉虱雌、雄两个样品中共获得10种分类操作单元(operational taxonomic unit,OTUs)。以16S rRNA基因为基础构建系统发育树,系统发育分析表明,螺旋粉虱雌、雄成虫体内优势菌群主要为发酵菌属Zymobacter,杀雄菌属Arsenophonus,泛菌属Pantoea和假单胞菌属Pseudomonas。Candidatus Portiera aleyrodidarum和Arsenophonus sp.可能为其体内共生菌群,在所有样品中均可稳定地检测到。这些微生物可能对螺旋粉虱生长发育、繁殖和性比调控起到重要的协同作用。

不同16S rDNA靶序列PCR-DGGE分析油页岩细菌多样性

为全面了解油页岩细菌群落组成结构,同时筛选出适于油页岩PCR-DGGE的最佳引物,采用改进SDS高盐提取法,提取抚顺西露天矿油页岩微生物总DNA,并用968F/1401R,338F/518R,341F/907R和1055F/1406R,对16S rDNA V6-V8,V3,V8和V9区进行PCR-DGGE分析.结果表明,4组引物均能较好扩增出目的基因,但不同靶序列对多样性检出有显著影响(P<0.001);与其他引物相比,968F/1401R和338F/518R获得的指纹图谱物种丰富度更高,检出细菌类群更丰富,较适合油页岩样品.油页岩细菌群落组成较简单,优势细菌包括不动杆菌属、假单胞菌属和埃希氏菌属,同时还有假单胞菌目和肠杆菌目尚未被鉴定的一些种类.

马铃薯软腐病菌的16SrDNA PCR检测

马铃薯软腐病是威胁马铃薯块茎的细菌性病害之一,为了提高马铃薯的品质与产量,减少贮藏期马铃薯块茎的腐烂,对马铃薯进行软腐病检测与鉴定是十分必要的。利用16SrDNA PCR对马铃薯软腐病原菌的进行检测,证实16SrDNA PCR检测技术是可行可靠的。在对PCR引物的筛选中,要根据所检测的对象进行有效、合理的设计,才能达到快速有效的目的。以马铃薯软腐病菌为代表,利用16SrDNA PCR进行鉴定,达到了预期的目的,为病原菌的快速鉴定方法提供了依据。

细菌16SrDNA基因PCR检测在败血症诊断的临床研究

目的建立细菌16SrDNA基因半巢式PCR检测方法,并与血培养方法比较,评估其在临床败血症的诊断价值。方法针对16SrDNA高度保守区设计半巢式PCR引物,并对92例临床疑为败血症的患者血标本同时进行血培养和16SrDNA基因检测。结果 92例疑为败血症患者16SrDNA基因检测阳性45例,阳性率为48.9%;血培养检测阳性标本24例,阳性率为26.1%。经χ2检验,PCR检测的灵敏性明显高于血培养(P<0.05)。结论半巢式PCR方法检测细菌16SrDNA基因具有高敏感、高特异及快速的优点,是一种易于推广的早期败血病诊断方法。

Applicability of PCR-DGGE and 16S rDNA Sequencing for Microbiological Analysis of Otitis Media with Effusion

Background: The aim of the study was to analyze the performance of PCR-DGGE based assay and its applicability as a tool for the identification of bacteria in the middle ear of children with otitis media with effusion (OME). Methods: The middle ear effusions from 20 children with OME were analyzed both by bacterial culture and by 16S rDNA-gene-targeted PCR assay, DGGE fingerprinting and sequencing analysis. Results: In bacterial culture assay, only three middle ear effusions (15%) showed bacterial growth. None of the samples were positive for anaerobic culture. The PCR assay with 16S rDNA-gene-targeted universal primers was positive in 10 (50%) cases. The subsequent DGGE fingerprinting and 16S rDNA sequencing analysis revealed that the most commonly encountered bacteria in the middle ear effusions of children with OME are Haemophilus influenzae, Alloiococcus otitidis and Bacteroides spp. Conclusions: The present study demonstrated the applicability of PCR-DGGE based assay and 16S rDNA sequencing for analyzing of bacterial diversity in the middle ear effusion of children OME. The results of our study may contribute to a better understanding of the etiology of OME.

PCR-DGGE研究处理垃圾渗滤液序批式生物膜反应器(SBBR)中的细菌多样性

为了研究序批式生物膜反应器中的细菌多样性及其脱氮的微生物学机理,为工艺改进提供依据,从同步高效去除垃圾渗滤液中高氨氮和高COD的SBBR生物膜和渗滤液原水中采集微生物样品并提取微生物总DNA,使用细菌通用引物对(GC341F/907R)从总DNA中成功扩增出目标16S rDNA片段,然后对扩增的16S rDNA进行DGGE,对凝胶染色并进行条带统计分析和切胶测序,使用序列数据进行同源性分析并建立了系统发育树.结果表明,该驯化后的SBBR生物膜和渗滤液原水中都有比较丰富的细菌多样性,驯化的生物膜细菌主要来自渗滤液原水,而且生物膜细菌在反应器正常运行时不会出现明显的群落结构变化;在该SBBR中有多种硝化细菌与反硝化细菌、好氧反硝化细菌和厌氧氨氧化细菌共存,说明该反应器中可能同时存在全程硝化反硝化、同步硝化反硝化和厌氧氨氧化3种脱氮方式.研究结果为SBBR脱氮微生物机理研究提供了一些有价值的参考依据.

PCR-DGGE对长江河口八种野生鱼类肠道菌群多样性的比较研究

目的分析长江河口捕获的8种野生鱼类的肠道菌群多样性的差异并观察这种差异与食性的联系。方法采用PCR-DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)技术,DGGE图谱用PCA(principal component analy-sis)方法进行分析。结果建立了长江口8种鱼野生条件下肠道菌群的DGGE指纹图谱,观察到它们在野生条件下的肠道菌群的差异。其中,营底栖生活的舌鰕虎鱼的肠道菌群和其他7种野生鱼有着明显的差异,其他7种鱼的肠道菌群多样性的差异与它们的食性差异相关。结论PCR-DGGE技术是一种能够快速有效地分析研究鱼类肠道菌群结构的技术。8种野生鱼的肠道菌群的结构有明显的差别。

内蒙古典型草原细菌群落结构的PCR-DGGE检测

用液氮冻融法和蛋白珠法对内蒙古典型草原土壤基因组DNA进行提取,用PCR-DGGE对细菌群落结构进行分析,并对主要的条带进行测序。发现蛋白珠法比液氮冻融法更能反应出实际的微生物群落结构和组成。内蒙古典型草原土壤细菌主要有5个分支:放线菌门(Actinobacteria),变形菌门(Proteobacteria)的α、β及γ类群,拟杆纲门(Bacteriodetes),芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)和酸杆菌门(Acidobacteria)。与基因库中进行比较后发现有4个序列和已知的细菌种类相似达到了99%以上。

利用PCR-DGGE技术指导高温油藏中功能微生物的分离

采用PCR-DGGE技术对高温油藏的微生物群落进行了多样性分析,并将得到的信息用于指导油藏微生物的分离.本研究通过PCR-DGGE技术对油藏水样中DNA的16S rDNA V3、V8、V9 3个高可变区的扩增产物进行了比较,确定采用可得到更多微生物多样性信息的V9区引物进行PCR扩增,优势条带序列分析表明,在高温油藏中存在的微生物与GenBank数据库中α,β,γ-变形杆菌和芽孢杆菌的序列相似性最高.利用多元细菌培养技术,以序列信息为指导,采用富集培养、直接培养和特殊培养的方法,从水样中分离出5株高温菌(而传统分离方法只能获得3株),其中3株高温解烃菌分别属于Bacillus属、Geobacillus属和Petrobacter属,它们能够在55℃以上兼性厌氧条件良好生长,对原油的降解率分别为56.5%7、0.01%和31.87%,对原油的降粘率分别为40%、54.55%和29.09%,使原油的凝固点分别降低3.7、5.2和3.1℃.因此,序列指导和改变培养条件是分离更多有效采油微生物的改进方法,这3株高温菌的对原油的作用效果证明其具备提高石油采收率的潜力.

传统分离培养结合PCR-DGGE技术分析传统乳制品中的乳酸菌

采用传统培养分离方法结合聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术对传统乳制品中乳酸菌种群结构进行研究。结果表明:用传统分离与分子鉴定方法得到5种乳酸菌,其中,乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)为优势菌群,对通过PCR-DGGE方法得到的9条16S rDNA条带序列进行了比对,结果表明瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)的丰度最高,是酸奶样品中主要的优势菌群,乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)为次优势菌群。传统分离法与PCR-DGGE技术结合能够更有效、更全面地分析传统乳制品中微生物的群落结构及优势菌群。

不同碳源强化生物除磷系统的PCR-DGGE分析

实验考察了不同碳源强化生物聚磷系统(EBPR)中的聚磷菌群,对3个不同碳源(1号实际生活污水、2号葡萄糖和3号乙酸钠)的序批式反应器(SBR)强化生物聚磷系统聚磷菌的16S rDNA特异性聚合酶链式反应(PCR)扩增产物进行了变形梯度凝胶电泳(DGGE)分析.结果表明,以生活污水为碳源的1号反应器具有数量最多的优势种群,而以葡萄糖和乙酸钠为碳源的2号、3号反应器的生物多样性较少.3个反应系统的微生物种群各有异同.具有除磷作用的未被培养细菌(条带3、4,AF527584、AF502204)为3个反应器所共有的生物量较多的优势种群,且其在以生活污水为碳源的1号反应系统中相对生物量最多.

OLAND生物脱氮系统中硝化菌群16S rDNA的DGGE分析

为了考察生物脱氮系统中硝化菌群 (氨氧化菌和亚硝酸氧化菌 )的种群多样性及硝化菌群随溶解氧降低的种群变化规律 ,并建立一套行之有效的用于自养生物脱氮系统中功能微生物菌群的快速分子检测技术 ,采用DGGE (变性梯度凝胶电泳 )分子检测技术对硝化菌群的 16SrDNA的特异性PCR扩增产物进行了分析 ,结果表明 :OLAND生物脱氮系统中氨氧化菌和亚硝酸氧化菌随溶解氧的降低表现出了不同的种群变化规律 ,氨氧化菌种群多样性受溶解氧的影响非常大 ,而亚硝酸氧化菌的种群多样性比较单一 ,且不受溶解氧的影响。结合FISH (全细胞荧光原位杂交 )分析结果表明 ,在OLAND限氧稳定运行后期 ,亚硝化单胞菌属 (Nitrosomonas)是主要的氨氧化菌 ,占OLAND限氧亚硝化阶段反应器中总细菌数的 72 .5

基于PCR-DGGE的浓香型白酒窖泥细菌群落结构研究

以30,100和200年窖龄窖泥为样品,采用PCR-DGGE技术探索不同窖龄窖泥细菌类群及群落演变规律.结果表明：不同窖泥样品DGGE图谱均出现14-23条较清晰的条带,其中共有优势条带为第4,11,19号,优势度均在2%以上.多样性指数在2.21-2.58之间,且随窖龄的增加而呈现增加趋势;相似性指数在0.427-0.629之间.30年与200年窖泥细菌群落聚为一类,相似性指数最高,达0.629.30年与100年窖泥细菌群落相似性指数最低,为0.427.PCR-DGGE图谱优势条带割胶测序结果显示：它们属于煎盘梭菌、耐乳酸杆菌、梭菌目细菌、Uncultured bacterium、丁酸梭菌、瘤胃球菌属、酪丁酸梭菌、醋酸杆菌属.