利用16S rRNA基因克隆文库分析东北自然发酵酸菜中细菌多样性

为了解传统酸菜自然发酵液中细菌多样性和群落的组成结构,采用构建16S rRNA基因文库的方法对酸菜成熟发酵液样品进行了研究.共获得98个克隆子,经过16S rRNA基因全长序列分析,鉴定为7个属,9个种,分别为Lactobacillu scoryniformis、Pediococcus parvulus、Citrobacter murliniae、Clostridium intestinale、Lactobacillu smalefermentans、LactobaciUu splantarum、Leuconostoc citreum、Achromobacter spanius和Enterobacter cloacae.其中,乳酸杆菌属（Lactobacillus）、片球菌属（Pediococcass）和构橼酸杆菌属（Citrobacter）为优势菌,分别占64.29％,22.45％和8.16％,其他种类分别占1.02％ ～2.04％.这些研究结果丰富和完善了酸菜发酵液微生物多样性信息,反映了微生物群落结构特点,为筛选有效的酸菜发酵菌剂提供了技术参考.

16S rDNA克隆文库方法分析好氧颗粒污泥细菌组成

采用构建16SrDNA克隆文库方法对好氧颗粒污泥的细菌种群多样性进行研究.随机测定了82个克隆子序列(700 bp),Blast比对结果表明,好氧颗粒污泥中微生物群落具有高度多样性,可分为7个主要类群,其中,β变形菌(β-Proteobacteria)类群和鞘脂杆菌(Sphingobacteria)类群在文库中所占比例最大,分别为34.16%和30.50%;其次是Candidate division TM7类群、黄杆菌(Flavobacteria)类群和γ变形菌(γ-Proteobacteria)类群,分别为9.76%,7.32%和7.32%;放线菌(Actinobacteria)类群和α变形菌(α-Proteobacteria)类群所占比例相对较小,分别为4.88%和1.22%.序列分析结果表明,好氧颗粒污泥中不仅含有对好氧颗粒污泥形成和稳定运行具有重要作用的食酸菌属(Acidovorax)细菌、假单胞菌(Pseudomonas)等细菌,还含有对CODCr和氨氮具有很好去除能力的Micropruina glycogenica,丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)等细菌.

16S rDNA克隆文库方法对制药废水处理系统中微生物多样性的研究

采用分子生物学构建16SrDNA克隆文库的方法对制药废水交替流生物反应器内的微生物群落进行了多样性研究,该反应器对CODcr、氨氮、石油类化合物以及多种特殊污染物均有较高的去除效率。代表序列的BLAST比对结果表明微生物群落具有高度多样性,优势菌群为Proteobacteria,占78.6%。微生物群落分属7个不同纲,优势顺序为Alphaproteobacteria(39.8%),Betaproteobacteria(23.5%),Gammaproteobacteria(14.3%),Chlorobi1(6.3%),Firmicutes(4.1%),Flavobacteria(1.0%),Deltaproteobacteria(1.0%)。使用VectorNTISuite6.0软件对50个OTU的代表序列和NCBI基因库中最相近的已知细菌16SrDNA序列绘制系统进化树,表明克隆子与已知菌之间的基因系统进化关系。

圈养老年大熊猫肠道菌群16S rDNA克隆文库的建立

为了研究老年大熊猫肠道菌群的构成,本试验对3只圈养老年大熊猫粪便细菌构建16SrDNA克隆文库,采用限制性内切酶HinfⅠ、MspⅠ对其进行限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)及测序分析。结果显示,老年大熊猫肠道细菌主要由变形菌门和厚壁菌门组成;变形菌门中又以大肠埃希氏菌属为主,其次为假单胞菌属、志贺氏菌属、气单胞菌属;而厚壁菌门中以链球菌属为主,其次为魏斯氏菌属、梭菌属;此外还发现一定比例的未培养细菌。本试验第一次建立了较丰富的老年大熊猫肠道菌群的克隆文库,为分析比较各年龄层大熊猫的肠道菌群结构的异同提供了参照,也为合理饲喂老年大熊猫,保障老年大熊猫的健康提供重要信息。

猪“高热病”源嗜麦芽窄食单胞菌16S rDNA基因的克隆和系统发育分析

根据NCBI中已报道的嗜麦芽窄食单胞菌16S rDNA基因序列设计引物,对两株来源于猪"高热病"病料中的疑似嗜麦芽窄食单胞菌PSM-5、PSM-6进行PCR扩增。将扩增产物克隆至pMD18-T载体上,并转化到DH5α中。抽取质粒模板,进行PCR和双酶切鉴定并测序,从分子水平上予以鉴定。两株菌的16S rDNA基因扩增片段的核苷酸序列(GenBank登录号为GQ267816和GQ267817)与已经报道的嗜麦芽窄食单胞菌分离株的16S rDNA序列的相似性均在96.78%以上,最高达99.93%。本试验对通过16S rDNA鉴定嗜麦芽窄食单胞菌提供一定参考,同时对猪"高热病"的诊断治疗奠定细菌学方面的基础,对其发病机制的探讨提供依据。

结合宏基因组末端随机测序和16S rDNA技术分析温室黄瓜根围土壤细菌多样性

土壤细菌在温室土壤环境中具有十分重要的生态功能,与温室作物以及微生物内部存在互作关系。研究土壤细菌的群落结构组成,有助于了解土地利用变化与生态环境效应之间的关系。结合16S rRNA基因克隆文库和宏基因组末端测序对温室黄瓜根围土壤细菌的多样性进行了分析。在16S文库中,根据97%的序列相似性水平划分OTU,共有35个OTU,其中优势菌群是γ-Proteobacteria,其次为Firmicutes,Bacillus为优势细菌。在纲分类水平上,16S文库和宏基因组末端测序结果均包含γ-Proteobacteria、α-Proteobacteria、δ-Proteobacteria、β-Proteobacteria、Actinomycetales和Firmicutes,各纲比例有差别;在优势种群属水平上,末端测序的结果包含的属多于16S文库(40>35);在优势细菌种类上,两者反映的结果一致,均为Bacillus。但是,宏基因组末端测序包含了大多数的弱势种群,更能反映细菌多样性的真实水平。与露地土壤细菌16S文库相比较,土壤细菌多样性降低,这可能与温室多年连作,种植蔬菜种类单一直接相关。

纤溶酶产生菌—藤黄微球菌的筛选、鉴定及纤溶酶基因的克隆

通过血粉培养基富集、纤维蛋白培养基筛选,从自然环境中分离到一株纤溶酶产生菌,命名为ML909。利用传统细菌分类鉴定方法对其形态和生理生化特征进行了研究,发现其与藤黄微球菌的特征相符,16SrDNA序列分析的结果也表明它与藤黄微球菌的16SrDNA序列的同源性高达99%,因此该菌在系统分类学上属于微球菌属(Micrococcus Cohn)藤黄微球菌(Micrococcus luteus)。通过PCR方法对其纤溶酶的编码区序列进行了克隆和序列分析,基因登录GenBank,登录号为EU232121。

东北虎粪细菌区系的16S rRNA基因序列分析

为研究东北虎粪微生物区系建立了东北虎粪细菌的16S rDNA文库.通过EcoRⅠ和HindⅢ分别对阳性克隆进行酶切分析,从东北虎的16S rDNA文库中分别获得了15个具有酶切差异的克隆.BLAST分析结果显示,在15个克隆中,10个克隆与梭菌属成员有97%以上的同源性,其中有6个序列与诺维梭菌A型(Clostridium novyi type A)有99%的同源性,为诺维梭菌A型;4个序列与猪粪细菌RT-18B(Swine manure bacterium RT-18B)有97%的同源性,为消化链球菌属(Peptostreptococcus)成员.其它序列与GenBank中登录的序列同源性低于97%,为5种未培养细菌,其中4种16S rRNA基因序列分别与Clostridium pascui 、破伤风梭菌E88(Clostridium tetani E88)、梭菌(Clostridium sp.)14505及产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)有94%～95%的相似性.第5种与肉杆菌(Carnobacterium sp.)R-7279株有94%的同源性.

交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)DY3菌株产内切葡聚糖酶的性质研究及基因克隆

从深海样品ES0 10 9中分离到一株具有高内切葡聚糖酶活力的细菌DY3 ,16SrDNA序列分析表明该菌与交替假单胞菌属 (Pseudoalteromonassp .)的Pseudoalteromonascitrea和Pseudoalteromonaselyakovii的同源性为 99%。PCR扩增DY3的内切葡聚糖酶基因celX全长 14 79bp ,编码一个 492AA的蛋白质。酶的氨基酸序列分析表明CelX与Pseudoalteromonashaloplanktis的内切葡聚糖酶CelG有 95%的相似性 ,包括一个糖基水解酶家族 5的催化结构域 ,一个连接序列和位于C端的的CBM5结构域。对酶性质的初步研究发现 ,CelX的最适温度为 40℃ ,酶的最适pH在 6～

一株耐热脂肪酶产生菌的鉴定及其脂肪酶基因的克隆

目的:从北方堆肥土样中分离、筛选获得产耐热脂肪酶的嗜热菌株FS32b,确定该菌株的分类学地位及其所产耐热脂肪酶基因。方法:通过研究该菌株16SrDNA基因序列的系统进化树,进行菌种分类鉴定并利用PCR技术获得其脂肪酶基因。结果:FS32b与报道过的Bacillus subtilisX60646有紧密的亲缘关系,二者的16S rDNA序列相似性为99%,其脂肪酶基因经序列测定分析表明,该菌株含长度为639bp的耐热脂肪酶基因的完整开放阅读框架(ORF)。此片断编码有213个氨基酸的酶。结论:FS32b初步鉴定为Bacillus subtilis,其脂肪酶基因的克隆为以后高效基因工程菌的构建奠定了基础。

地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的克隆与表达

产淀粉酶高温菌在淀粉酶的生产中具有重要意义。从温泉中分离到1株可在60℃快速生长的淀粉酶产生菌A12 ,经16SrDNA序列比较和丙酸盐利用等实验将其鉴定为地衣芽孢杆菌。构建了地衣芽孢杆菌A12基因文库,并从中克隆到一个α -淀粉酶基因amyA1,对其进行了测序分析,并在大肠杆菌中实现了表达。本研究为构建一个耐高温淀粉酶生产用工程菌奠定了基础。

油藏水样细菌群落16S rRNA基因的RFLP分析

通过16S rRNA基因的限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)方法,考察了油藏水样中细菌群落及多样性。从水样中分离纯化微生物总DNA,选择性扩增细菌16S rRNA基因,并构建16S rDNA克隆文库。337个16S rDNA克隆片段分别用限制性内切酶HinfⅠ和HaeⅢ酶切分析,得到74个操作分类单元(OTUs),其中数量最多的4个OTUs共占克隆子总数的73.6%,另外70个OTUs的丰度均处于较低水平,有57个OTUs仅含有1个克隆子。结果表明,运用RFLP方法分析16S rDNA克隆片段能够有效评估油藏水样中的细菌群落和多样性。

利用一碳化合物(C1)细菌的分离及基因组文库的构建

从污水样品中筛选到能利用甲醇的菌株B,经16SrDNA测序分析鉴定为肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumo-niae)。甲醛耐受能力的测试表明该菌对甲醛具有较强耐受能力,能在含有8￣15mmol/L甲醛的LB培养基上生长。Southern杂交分析说明这菌株的基因组中有甲基营养菌6-磷酸己酮糖合成酶(HPS)和6-磷酸果糖异构酶(PHI)基因的同源序列。本研究以pUC118为载体构建了基因组文库,进一步检测结果说明所构建的基因组文库质量符合要求。

利用16S rRNA分析传统四川发酵泡菜中的细菌多样性

为了解传统四川发酵泡菜中的细菌多样性,采用构建16S rRNA基因文库的方法,对样品进行研究。结果表明:通过16S rRNA基因序列分析,所得到129个克隆子均鉴定为乳酸菌,分布于Lactobacillus和Pediococcus两个属,所占比例分别为88.4%和10.1%。L.pentosus、L.plantarum和P.damnosus是其中的优势菌种分别占50.4%、16.3%和10.1%,L.paralimentarius、L.sunkii、L.brevis、L.kisonensis、L.acetotolerans、L.namurensis分别占7.8%、4.7%、3.1%、1.6%、0.8%和0.8%,且P.damnosus、L.paralimentarius、L.sunkii、L.kisonensis和L.acetotolerans均在泡菜中发现。这些结果揭示四川泡菜中的微生物多样性,反映其中的微生物群落结构,展现很多未知的生物信息。

太湖不同湖区真核微型浮游生物基因多样性的研究

用DGGE（denatured gradient gel electrophoresis）和构建18SrDNA克隆文库2种方法对太湖不同湖区的真核微型浮游生物（0.8-20μm）多样性及组成结构进行了研究.DGGE结果表明,不同湖区真核微型浮游生物的DGGE指纹图谱存在明显差异,其中营养水平较低的东太湖和贡湖DGGE条带数最多,分别为23和24,香农多样性指数分别为3.135和3.178,而营养水平较高的梅梁湾和五里湖最少,均为18,香农多样性指数为2.890,表明营养水平较低湖区的多样性高于营养水平较高的湖区.克隆测序结果表明太湖中真核微型浮游生物种类丰富,占优势的主要是一些鞭毛藻、异养鞭毛虫、纤毛虫和真菌,而营养水平不同的梅梁湾、湖心、东太湖中真核微型浮游生物组成明显不同.在营养水平较高的梅梁湾,28.6%的OUT（operational taxonomicunit）属于异养鞭毛虫,另外隐藻、金藻分别占22.9%和14.3%;在湖心,金藻的比例最大,占25.7%,另外比较多的是异养鞭毛虫和隐藻,分别为20.0%和14.3%;而营养水平较低的东太湖各类纤毛虫所占比份最大,为26.8%,异养鞭毛虫较少,仅占4.9%,另外真菌含量较高,占12.2%.

16S rDNA克隆文库法探索转基因香石竹对土壤细菌群落的影响

【目的】通过研究转基因香石竹对土壤细菌群落的影响,为转基因香石竹的环境安全性评价提供依据。【方法】通过构建16S rDNA克隆文库,分析种植转基因和非转基因香石竹的土壤中细菌的群落结构组成。【结果】转基因和非转基因香石竹土壤中,共有的菌群有变形菌门(Proteobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、酸杆菌门(Acidobacteria),其中α-变形菌门、β-变形菌门、浮霉菌门为优势菌群;而在放线菌门(Actinobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)及未培养菌(Uncultured bacterium clone)等菌群存在部分差异。【结论】通过16S rDNA克隆文库方法揭示了转基因香石竹的土壤中细菌多样性十分丰富,其栽培对土壤细菌群落结构影响有限。

深海沉积物样品中古菌的16S rDNA分析

利用多管采样器,在太平洋西经177°42′20″,北纬10°35′06″的位置上,从水深5774m的海底获得深海沉积物样本,现场提取DNA进行保存,以此DNA为模板,利用古菌16S rDNA特异引物扩增出样品中古菌的16S rDNA,将扩增所得的16S rDNA进行克隆,建立了该样品中古菌的16S rDNA文库。对16S rDNA扩增片段进行了RFLP分析和序列分析,结果表明这些古菌在系统进化树上的位置靠近,属于Crenarchaeota中的Ⅰ类海洋古菌类群。

转几丁质酶和葡聚糖酶双价基因棉花对土壤细菌种群多样性的影响

以转几丁质酶和葡聚糖酶双价基因棉花为研究对象,非转基因受体棉花为对照,通过比较可培养细菌数量和基于16S rRNA克隆文库细菌种群分析,评价外源双价基因的导入在苗期、蕾期、花铃期和吐絮期对棉花根际细菌群落多样性的影响。结果表明,可培养细菌的数量不受外源双价基因的影响,随着棉花生育期的交替而变化,以代谢旺盛的花铃期最多。构建的转基因和非转基因不同生育期根际土壤细菌16S rRNA文库容量为2400个克隆,涵盖了细菌的283个属。其中,Acidobacterium是最大优势类群,共包括624个克隆,其次为未知细菌种群和Flavisolibacter。比较转基因和非转基因棉花根际土壤细菌的种群结构,结果显示,同一生育期内前者种群的多样性显著低于后者,二者的共有类群随着生长发育的进行而增多。研究结果说明几丁质酶基因和葡聚糖酶基因对棉花根际细菌种群多样性有着不同程度的削减作用,但是随着种植时间的延长,该差异呈现逐渐缩小的趋势。

应用16S rDNA克隆文库技术研究脱硫废弃物对盐碱地土壤细菌多样性的影响

应用16SrDNA克隆文库技术，直接提取土壤微生物总DNA，研究了施用燃煤烟气脱硫废弃物（简称脱硫废弃物）后对盐碱地土壤细菌群落结构的影响。采集宁夏银北西大滩设置的大田试验对照（cK）和施用脱硫废弃物0．74gm-2（T）处理的0—20am和20—40cm两个土层的土壤样品，分别构建细菌16SrDNA克隆文库，并进行序列测定和分析。结果表明：施用脱硫废弃物显著改变了土壤中细菌群落结构，细菌的多样性指数和均匀度均有所升高，这表明细菌的多样性有所提高。并且检测到土壤中放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflezi）、酸杆菌门（Acidobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、蓝细菌（Cyanobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）及未培养菌（Unculturedbacteriumclone）等菌群，其中放线菌门为优势菌群，分别占到细菌总量的36．4％、33．8％、24．7％、30．1％。施用脱硫废弃物后增加了0～20cm土层的变形菌门，减少了放线菌门和厚壁菌门。16SrDNA系统发育分析表明，施用脱硫废弃物对变形菌门群落结构影响最大，其次是放线菌门、厚壁菌门、疣微菌门。

利用非培养技术研究芝麻香型白酒高温大曲的细菌群落多样性

采用构建16S rDNA克隆文库的非培养方法,对我国芝麻香型白酒高温大曲细菌的群落结构及其多样性进行研究。文库中含有24个分类操作单元(OTU),优势菌属(丰度)分别为Thermoactinomyces sp.(51.99%),Kroppenstedtia sp.(17.38%),Saccharopolyspora sp.(13.87%),Lactobacillus sp.(6.95%)和Weissellasp.(4.96%)。首次在高温大曲中发现Thermoactinomyc vulgaris和Kroppenstedtia eburnea;同时发现3个潜在细菌新种,分属于Saccharothrix sp.,Streptoalloteichus sp.和Pseudofulvimonas sp.。