基于16S rRNA基因扩增子测序技术研究云南野生小型哺乳动物肠道菌群多样性

以生活在同一生境,但具有不同进化关系和不同食性的野生哺乳类动物(鼠科、猬科和鼩鼱科)为研究对象,通过16S rRNA基因扩增子测序,分析和比较其肠道菌群。共识别出5378个操作分类单位(OTUs),主要隶属Firmicutes(40.55%),Proteobacteria(34.60%)和Bacteroidetes(13.67%)。Firmicutes和Bacteroidetes是鼠科的优势菌门,Proteobacteria是猬科和鼩鼱科的优势菌门。多样性分析表明,鼠科、猬科与鼩鼱科的肠道微生物多样性及群落结构具有显著性差异;LEfSe分析表明,鼠科中存在更多与复杂碳水化合物发酵相关的细菌,猬科和鼩鼱科中含较多氨基酸发酵菌;益生菌(如Lactobacillus和Lactococcus等)共存于这3类野生小型哺乳类动物中,起调控宿主健康的作用。研究结果揭示,宿主食性与进化关系影响着野生小型哺乳动物肠道菌群结构,而肠道菌群可能在多种方面对宿主起益生作用。

植物内生菌16S rRNA基因扩增子高通量测序中降低宿主污染的方法

植物内生菌能够帮助植物生长,增强其抗逆性与抗病性,研究植物内生菌对了解植物入侵机制、保护生态环境与农业的健康发展具有重要意义。通过阅读相关文献,总结归纳了降低植物内生菌16S rRNA基因扩增子高通量测序(16S-seq)中宿主基因污染的4种方法,即:①寻找特异性错配引物用来扩增细菌16S rRNA基因;②添加特异性阻断物用来抑制宿主16S rRNA基因扩增,如PNA-PCR和LNA-RCR钳位技术;③在文库构建过程中剪切宿主细胞器的16S rRNA基因,如Cas-16S-seq方法;④改变PCR扩增流程,如巢式PCR技术。了解上述各种方法的特点,有助于在植物内生菌16S-seq中选择合适的方法,避免或者减少宿主基因的污染,更准确地进行植物内生细菌群落的研究。

微生物扩增子高通量测序技术在水产品加工与贮藏中的应用

简介了微生物扩增子高通量测序技术,简述该技术在水产品加工与贮藏研究中的应用现状。在发酵水产品、水产品低温加工和保鲜防腐等方向,众多研究以高通量方法测定细菌和古菌的16S rRNA基因片段,准确获得水产品中微生物的种类和数量信息。微生物扩增子高通量测序技术优于传统的可培养法,也优于许多非培养分析技术。同时还指出了该技术的存在问题及对策,并探讨了该技术的发展方向和应用前景。

扩增子测序技术分析红茶菌中优势微生物的研究

红茶菌作为一种传统健康保健饮品,由于发酵过程中需要多种微生物的参与,因此需要对混合菌种进行高效的分离鉴定。本文通过提取红茶菌中的基因组DNA,采用高通量测序的方法对16S rDNA和ITS的扩增子进行测序,实现对红茶菌中优势微生物的分析鉴定。通过对可操作分类单元进行丰度分析和物种分类树统计,最终得到主要的细菌组成为:醋酸菌89.11%,拟杆菌5.56%,颤螺旋杆菌1.77%;优势真菌组成为:酵母菌为93.48%,其中嗜酒假丝酵母61.76%,酵母菌Blastobotrys adeninivorans 30.97%;α多样性分析结果显示:测序数据较为合理,测序数据量大,可以反映样品中绝大多数的微生物物种信息。

基于16S rDNA扩增子测序与流式细胞仪分析葛根改善免疫与肠道微生物的关系

本文基于16S rDNA扩增子测序与流式细胞仪深入探索葛根改善免疫的机制,并分析肠道微生物与免疫的关系。葛根灌胃四周后,取血,测定血清中TNF-α、IFN-γ、IL-6,运用流式细胞仪测定血清中T、B淋巴细胞数量,16S rDNA扩增子测序粪便中肠道微生物菌群变化。结果显示,与空白对照组比较,各剂量葛根皆降低炎性因子,改善机体免疫状态,其中以低剂量最为显著(P < 0.05)。流式细胞仪结果显示,各剂量组葛根提取物都显著增加血清中T、B淋巴细胞数量(P < 0.05),增长幅度以低剂量最为显著(P < 0.01)。16S rDNA扩增子测序结果显示,葛根提取物可以特异性增高与免疫相关肠道微生物的丰度,如梭状芽孢杆菌、罗氏杆菌、狄氏副拟杆菌、肠球菌等,以狄氏副拟杆菌最为显著。Alpha多样性指数组间差异分析提示葛根能够提高肠道微生物的丰度,提高微生物分布均匀性。PCoA分析提示葛根能较显著改变肠道内微生物的菌种丰度与组成结构。因此,葛根能够提高免疫功能,降低炎性因子,增加T、B淋巴细胞数量,并可能通过特异性改变肠道微生物,如狄氏副拟杆菌,增加肠道微生物多样性等途径发挥免疫调节作用。

16SrDNA测序在细菌性重症肺炎痰液致病菌分析中的应用

目的 采用16S rDNA测序,分析重症肺炎痰液中致病菌构成,探索病原学诊断的新方法.方法 收集细菌性重症肺炎患者的痰液标本,运用聚合酶链反应（PCR）扩增及高通量测序技术,对标本中病原菌16SrDNA V3～V5区进行多样性分析.结果 测序显示痰液样本含有的物种种类相对较多,还存在较多未被测序检测到的物种,优势菌属主要为链球菌属、变性菌属、不动杆菌属、鞘氨醇单胞菌属、普氏菌属、克雷伯菌属、假单胞菌属、水杆菌属、棒状杆菌属等.结论 细菌性重症肺炎痰液致病菌种复杂多样,物种丰富,16S-rDNA测序是临床实践中一种新的尝试.

一株芽孢杆菌16SrRNA的基因序列测定和系统进化分析

从河南黄河稻区土壤中分离出一株具有较强稻瘟病菌拮抗活性的芽孢杆菌菌株BS501,经过形态观察、生理生化特性检测和电镜技术,确定其为芽孢杆菌属细菌。为进一步确定其分类学地位,扩增了BS501基因组的16S rDNA,并将测序结果提交GenBank数据库(登录号:FJ755787)。利用BLAST软件将该序列与枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等芽孢菌属细菌及大肠杆菌16S rDNA序列进行同源性比对。系统进化树表明,BS501与芽孢菌属细菌在进化关系上组成一个大的分支,与枯草芽孢杆菌最为接近,与大肠杆菌较远。同源性分析表明该序列与枯草芽孢杆菌PRE23同源性达99%,证实该菌株的分类学地位为枯草芽孢杆菌。

橡树岭军团菌的分离及用16S rDNA测序法的鉴定

军团菌属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌａ）自１９７１年确定以来，现已有３９个成员。军团菌属主要分布于供水系统中，如空调冷却塔水和浴池淋浴水中。我们曾于１９９４年从北京某宾馆冷却塔水中分离出一株可疑军团菌，但因缺乏标准抗血清而未能定种。由于核酸分析技术和细菌鉴定观念上进步，使我们能根据１６ＳｒＤＮＡ序列比较推测细菌间进化关系，并进而对未知细菌进行鉴定和检测。我们用以１６ＳｒＤＮＡ为靶序列的ＰＣＲ和测定鉴定，确定了该分离株为橡树岭军团菌（Ｌ．ｏａｋｒｉｄｇｅｎｓｉｓ）。

16SrDNA序列分析在鉴定30个中药品种中沙门氏菌的应用

目的建立中药品种中沙门氏菌的16SrDNA序列分析方法 ,评价该方法鉴定沙门氏菌的实用性和准确性。方法用PCR扩增各个中药品种中沙门氏菌的16SrDNA片段,将扩增后的产物纯化后,使用ABI310型基因测序仪进行测序,随后使用ABI自带菌库进行序列比对,做出相似性分析,鉴定各菌种。结果沙门菌的分型比较多,核苷酸序列相似性达到99%以上,无法准确地对沙门菌的各个分型完全鉴定,故结果依赖于个菌库的全面性,以及进一步与血清学实验结合判定。结论 16SrDNA序列分析是一种简单,快速,特异性较强的微生物鉴定方法 ,但对于基因序列极其相似并且分型各不相同的沙门氏菌,还需与其他方法结合进行鉴定。

四株细菌纤维素生产菌株16SrDNA序列分析及生产性能比较研究

对实验室筛选保藏的DHU-HL-Z1、DHU-HL-Z2和DHU-HL-Z3三株细菌纤维素(bacterial nanocellulose,BNC)生产菌株和对照菌Komagataeibacter xylinus ATCC 23770进行16SrDNA序列分析以及BNC生产性能比较。序列分析结果显示三株菌均属于木葡糖醋杆菌K. xylinus,与已报道的多株BNC生产菌株亲缘性较近。该三株菌的产量(12.8～14.8 g/L)均明显高于8.7 g/L(p>0.05)。DHU-HL-Z1和DHU-HL-Z2所产BNC的结晶度(87.64%和86.65%)明显高于对照菌ATCC 23770(62.34%)。凝胶膜力学性能方面,DHU-HL-Z2、DHU-HL-Z3和DHU-HL-Z1的杨氏模量分别为130 KPa、96 KPa和39 KPa,均高于ATCC 23770的23 KPa。结果表明三株保藏菌优良性能,在BNC研究和生产领域具有很好的利用价值。

16SrDNA技术探讨冠状动脉粥样硬化斑块中牙周致病菌的分布特点

目的:通过16SrDNA技术检测冠状动脉粥样硬化斑块中的病原微生物-牙龈卟啉单胞菌(P.g)、福赛类杆菌(T.f)、具核酸杆菌(F.n)、及中间普氏菌(P.i)并探讨其分布特点,为冠心病和牙周炎可能的相关性提供依据。方法:选择94例行冠状动脉搭桥术的患者,术中收集冠状动脉粥样硬化斑块,采用牙周致病菌特异性引物,通过(polymerase chainreaction,PCR)技术,检测粥样硬化斑块中的病原微生物,同时对扩增产物进行测序分析,并与基因库中的已知序列进行比对。结果检测发现粥样硬化斑块中T.f的阳性率37%,P.g的阳性率28%,F.n的阳性率18%及P.i的阳性率12%。结论:从94例动脉粥样硬化斑块中检测出牙周致病菌,表明冠心病和慢性牙周炎可能有相关性。其中T.f的检出率最高,P.i最低,为进一步探讨牙周致病菌在动脉粥样硬化发生、发展中作用,奠定了基础。

基于16S rDNA分析首发抑郁症患者的代谢紊乱因素

目的通过16S rDNA测序技术对首发抑郁症患者肠道菌群分布、多样性和基因功能进行分析,探讨抑郁症患者代谢变化的情况。方法选取首发抑郁症患者13例为研究组,选取本市健康对照11名为对照组。采用16S rDNA基因测序法对两组肠道菌群进行物种注释分析和功能比较,统计两组肠道菌群分布、多样性和基因功能的变化。结果PCoA分析显示,两组群落组成结构比较,差异有统计学意义(P<0.05)。在门水平,研究组厚壁菌门(Fimicutes)降低、拟杆菌门(Bacteroidota)升高(P<0.05)。在属水平,研究组拟杆菌属(Bacteroides)和副拟杆菌属(Parabacteroides)的丰度升高(P<0.05)。研究组标志微生物为:变形菌纲(Alphaproteobacteria),拟杆菌门(Bacteroidota),拟杆菌纲(Bacteroidia)和拟杆菌目(Bacteroidales)。在三级KEGG途径分类下,与对照组相比,研究组苯丙氨酸生物合成、色氨酸生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、缬氨酸合成、亮氨酸和异亮氨酸合成、胰岛素抗性和胰岛素信号路径的基因表达量降低(P<0.05),转运功能、缬氨酸降解、亮氨酸和异亮氨酸降解、脂肪酸降解、谷胱甘肽代谢和PPAR信号路径的基因表达量升高(P<0.05)。结论肠道菌群结构及其基因功能的改变是导致机体代谢紊乱的重要因素,检测肠道菌群变化可为临床防治抑郁症提供新思路,依据基因功能变化可为研究抑郁症发生的具体机制提供参考。

肠道微生物测序研究中不同实验来源差异的综合评价以及应用

肠道微生物测序研究具有将微生物结果转化为人类健康的巨大潜力。16S扩增子测序和宏基因组鸟枪测序(whole-metagenome shotgun,WMS)是微生物组研究中的两大主要方法,各具优势。然而,研究样品的异质性、测序仪和文库制备方法的差异如何影响肠道微生物测序结果的可重复性仍有待深入研究。该研究旨在通过比较粪便样本中微生物组成的差异,为测序技术的选择提供参考标准。3种广泛采用的测序仪的结果显示,WMS法中技术重复相关性(r=0.94)较高,而生物学重复相关性(r=0.69)较低。Bray-Curtis距离表明,生物学重复的差异大于技术重复(P<0.001)。此外,16S和WMS数据集间具有明显的分类学图谱差异。研究结果表明,同质化是样品DNA提取前的一个必要步骤;测序仪对分类学变异的贡献小于文库制备方法。我们开发了经验贝叶斯方法,即在计算中“借用信息”,利用标准化数据和(非)参数先验分布分析批次效应参数,提高了16S和WMS之间的群体可比性,为进一步应用于融合分析已发表的16S和微生物数据集提供了依据。

血清凝集、基因测序联合检测群霍乱弧菌的应用

目的：避免霍乱弧菌检测假阳性，提高检测正确率。方法随机选取2013年1～7月，全国各省市 CDC 送往中国CDC 霍乱初筛阳性菌株14株；用 LB 营养琼脂培养12 h，挑取单菌落进行霍乱弧菌血清凝集，同时水煮模板法提取菌株的DNA。针对弧菌属16SrDNA 序列设计引物，进行弧菌16SrDNA PCR 检测，电泳观察16SrDNA 产物，将16SrDNA 阳性产物送测序公司测序，测序结果在 NCBI 网站上进行 Blast 比对，分析比较血清凝集和 Blast 比对结果。结果共选取14株菌进行实验，血清凝集阳性12株，2株未凝。经弧菌16SrDNA 扩增，电泳观察14株菌均扩增出相应的片段，说明所选菌株均为弧菌属。将14株菌的16SrDNA 阳性产物测序，并将测序结果进行 Blast 比对：2株血清未凝集菌均是哈维氏弧菌；12株血清凝集阳性的菌中，1株是需钠弧菌，其余11株是霍乱弧菌。结论血清凝集和基因测序联合检测群霍乱弧菌，可避免霍乱弧菌检测假阳性，提高检测正确率。

基于16S rDNA扩增子测序及靶向代谢组学探究“脾应长夏”的物质基础

目的:通过长夏时节肠道菌群及其代谢短链脂肪酸的季节性特征研究松果腺介导的“脾应长夏”的物质基础,丰富中医“天人相应”理论内涵。方法:将SD大鼠随机分为空白组、伪手术组和手术组,采用人工气候模拟系统模拟长夏气候特征饲养4周,观察各组大鼠一般状态及粪便含水率,从宏观上对比研究脾运化水液能力;应用16S rDNA扩增子测序和靶向代谢组学技术进一步剖析松果腺对大鼠肠道菌群及短链脂肪酸的调控情况。,结果:切除大鼠松果腺后,第14、28天,手术组大鼠体质量与伪手术组比较,显著下降(P<0.05),粪便含水率比空白组显著增加(P<0.01);长夏环境中大鼠肠道菌群以厚壁菌门为主,伪手术组代表性物种为梭菌目、毛螺菌科和瘤胃菌科等,而手术组厚壁菌门丰度有所减少,代表性物种为脱硫弧菌属、韦荣球菌科以及苏黎世杆菌科;手术组大鼠肠道短链脂肪酸与空白组比较,乙酸、异丁酸、丁酸、戊酸、异戊酸和己酸显著降低(P<0.01,P<0.05)。结论:“脾应长夏”的物质基础可能与松果腺通过调节肠道菌群及短链脂肪酸代谢实现机体对自然环境的适应调节相关。

利用16SrDNA快速鉴定自制酸奶中5种双歧杆菌的研究

文章建立了自制酸奶中5种双歧杆菌的鉴定方法,评价该方法鉴定双歧杆菌的实用性和准确性。将酸奶中5种双歧杆菌分离纯化培养后,用PCR扩增双歧杆菌的16SrDNA片段,将扩增产物纯化后,使用ABI PRISM 310型基因测序仪进行测序,随后使用ABI自带菌库和互联网菌库等进行序列比对,做出相似性分析,鉴定出5株菌分别为长双歧杆菌、短双歧杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和青春双歧杆菌。该方法可以快速准确地鉴定出酸奶中的双歧杆菌类型。

16S/18S/ITS扩增子高通量测序引物的生物信息学评估和改进

【背景】在过去的十几年里,基于核糖体RNA基因的扩增子测序技术被广泛用于各种生态系统中微生物群落的多样性检测。扩增子测序的使用极大地促进了土壤、水体、空气等环境中微生物生态的相关研究。【目的】随着高通量测序技术的不断发展和参考数据库的不断更新,针对不同的环境样本的引物选择和改进仍然需要更深入的校验。【方法】本文收集了目前在微生物群落研究中被广泛采用的标记基因扩增通用引物,包括16S rRNA基因扩增常用的8对通用引物和2对古菌引物、9对真菌转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)基因扩增引物,以及18S rRNA基因扩增的4对真核微生物通用引物和1对真菌特异性引物。这些引物中包括了地球微生物组计划(Earth Microbiome Project,EMP)推荐的2对16S rRNA基因扩增引物、1对ITS1基因扩增引物和1对18S rRNA基因扩增引物。采用最近更新的标准数据库对这些引物进行了覆盖度和特异性评价。【结果】EMP推荐的引物依然具有较高的覆盖度,而其他引物在覆盖度及对特定环境或类群的特异性上也各有特点。此外,最近有研究对这些通用引物进行了一些改进,而我们也发现,一个碱基的变化都可能会导致评价结果或扩增产物发生明显变化,简并碱基的引入既可以覆盖更多的物种,但同时也会在一定程度上降低关注物种的特异性。【结论】研究结果为微生态研究中标记基因的引物选择提供了一个广泛的指导,但在关注具体科学问题时,引物的选择仍需数据指导与实验尝试。

基于16S rRNA基因扩增子测序分析日本囊对虾肠道菌群结构与功能的特征

【背景】肠道菌群在对虾的生理活动中起关键作用。日本囊对虾是我国海水养殖虾类中的主要品种之一,迄今为止有关其肠道菌群结构与功能的研究还鲜有报道。【目的】利用高通量测序技术探究日本囊对虾肠道菌群的组成结构与功能作用,揭示虾体肠道菌群与外源菌群结构间的相关性。【方法】60 d的养殖周期结束后,分别采集日本囊对虾肠道样品(归为虾肠组,n=3)、养殖水体样品(归为水体组,n=3)和对虾饲料样品(归为饲料组,n=3),提取各样品总DNA进行16SrRNA基因扩增子测序,基于生物信息学方法分析与比较样品间的菌群结构特征,并使用PICRUSt软件预测日本囊对虾肠道菌群功能。【结果】3组样品测序共获得822713条有效序列,抽平处理后可聚类为3416个OTU。虾肠组样品中有28.49%、59.30%的OTU可以依次在水体组、饲料组样品中检测到。门水平上,虾肠组样品中的优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和梭杆菌门(Fusobacteria)。水体组、饲料组与虾肠组样品中的优势菌门结构不尽相同,但均由变形菌门和拟杆菌门组成。属水平上,虾肠组样品中的优势菌属包括弧菌属(Vibrio)、另类弧菌属(Aliivibrio)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、假黄棕杆菌属(Pseudofulvibacter)、科尔韦尔氏菌属(Colwellia)、小纺锤状菌属(Fusibacter)、发光杆菌属(Photobacterium)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)以及弓形杆菌属(Arcobacter)。水体组和饲料组中检出的核心菌属结构与虾肠组相比有明显差异,其中海命菌属(Marivita)和假单胞菌属(Pseudomonas)分别为养殖水体及对虾饲料样品中的最优势菌属。PICRUSt预测结果显示,日本囊对虾肠道菌群的基因功能主要与新陈代谢类功能有关,包含氨基酸代谢、碳水化合物代谢与能量代谢等。【结论】日本囊对虾肠道菌群与其他种类对虾肠道菌群的结构间存在共性,其形成在一定程度上受到了外源菌群的干预,并在虾体的日常代谢活动中发挥了一定的作用。

南沙群岛珊瑚礁区黑斑鹦嘴鱼(Scarus globiceps)食性分析

鹦嘴鱼科(Scaridae)鱼类参与珊瑚礁生态系统诸多关键生态过程,在维持珊瑚礁生态系统稳定与平衡中发挥着重要作用。由于以往研究手段的限制,对鹦嘴鱼的食物来源及生态功能价值认识不足,在其功能定位方面存在较多争议。本研究选择珊瑚分布的典型区域—南沙群岛中的东门礁和南薰礁为研究海域,对该海域鹦嘴鱼优势种类黑斑鹦嘴鱼(Scarus globiceps)摄食的藻类多样性进行全面分析。通过18S rDNA和16S rDNA多基因条形码技术,分别对黑斑鹦嘴鱼肠含物的真核藻类和原核藻类DNA进行高通量测序分析。18S rDNA的测序结果发现,黑斑鹦嘴鱼类的肠含物中真核藻类以甲藻(Dinoflagellata)、红藻(Rhodophyta)、绿藻(Chlorophyta)、褐藻(Ochrophyta)为主,共计77个OTU(operational taxonomic units)。甲藻相对序列丰度和多样性较高,序列比例占真核藻类序列总数的51.42%,其中网甲藻科(Suessiaceae)OTU_5在东门礁和南薰礁的样品中均超过20%。16S rDNA测序鉴定发现肠含物含有原核藻类(蓝藻)的序列,共计21个OTU,其中以念珠藻目(Nostocales)的相对序列丰度最高,达到39.33%。本研究表明,黑斑鹦嘴鱼在摄食过程中会摄入一定量大型藻类,但微藻(甲藻)序列占据优势地位,蓝藻在肠含物中也有较高的检出率,说明需要重新考虑微藻(甲藻和蓝藻)在鹦嘴鱼食源中的重要贡献以及对珊瑚礁生态系统结构与功能的影响。

妊娠期糖尿病对母乳喂养的12周龄婴儿肠道菌群影响

目的比较妊娠期糖尿病(GDM)及正常孕妇的持续母乳喂养的12周龄婴儿肠道菌群的分布特点,以探索GDM对12周龄婴儿肠道菌群的影响。方法选择2016年6月—2019年12月入组的母亲及其随访至12周龄的母乳喂养的婴儿,依据母亲孕期血糖检测结果将母乳喂养婴儿分为GDM组(n=13)和对照组(n=27)。采集婴儿12周龄粪便,采用16S rDNA高通量测序技术对所有粪便样本进行检测,比较两组肠道菌群分布特点。采用Spearman相关分析法分析肠道菌群与孕期血糖、婴儿体重的相关性。结果共纳入40对研究对象,GDM组13对,对照组27对。两组的优势菌门均为放线菌门、厚壁菌门和变形菌门,GDM组的疣微菌门相对丰度高于对照组,差异有统计学意义(Z=2.233,P<0.05)。在属水平上,GDM组中肠道菌群优势菌属来自放线菌门和厚壁菌门,对照组中肠道菌群的优势菌属来自放线菌门、厚壁菌门和变形菌门。LEfSe差异分析结果显示,GDM组中疣微菌门/目/科、阿克曼氏菌、劳森氏菌、哈利真杆菌的丰度明显升高(LDA>2),而在对照组中芽孢杆菌目、孪生球菌属、丹毒梭菌属的丰度明显升高(LDA>2)。肠道优势菌群的门水平丰度与孕期血糖、12周龄婴儿体重均不相关(P>0.05)。结论孕期GDM对持续母乳喂养的12周龄婴儿肠道菌群构成产生一定的影响。