用16SrRNA序列分析技术检测龈下菌斑中致病菌

目的建立牙周致病菌的16SrRNA序列分析方法,检测龈下菌斑菌群的分布。方法对376例牙周病患者(其中成年组306例、儿童组70例)龈下菌斑,采用Chelex-100法提取细菌DNA,16SrRNA序列分析技术检测牙龈卟啉单胞菌(Pg)、伴放线嗜血杆菌(Aa)、福赛斯坦纳菌(Tf)、具核梭杆菌(Fn)、中间普氏菌(Pi)等5种牙周炎相关致病菌。结果376例牙周病患者龈下菌斑中5种牙周炎相关致病菌PCR法与培养法检出率分别为Pg(40.96%,17.82%)、Aa(19.15%,9.31%)、Tf(88.56%,27.66%)、Fn(81.91%,23.67%)、Pi(57.98%,19.15%);除Aa外前者检出率明显高于后者(P<0.01)。结论16SrRNA序列分析法具有检出率高、稳定性好以及高度的特异性和敏感性,是一种比较适合临床应用的牙周菌斑检测方法。

采用16SrRNA序列分析方法鉴定第四次全国结核病流调的非结核分支杆菌

目的 从核苷酸序列水平建立一种非结核分支杆菌的鉴定方法，以用于其流行病学调查。方法 对第四次全国结核病流行病学抽样调查获得的49株非结核分支杆菌，采用16SrRNA基因片段序列分析的方法进行鉴定，结果 五株标准菌株的测序结果与其命名完全相符。49株流调非结核分支杆菌中．41株可明确鉴定，4株不能明确鉴定到种，4株扩增失败无法鉴定。所占比例较高的菌种为：不产色分支杆菌(7/41)，土地分支杆菌(6／41)，胞内分支杆菌(5／41)，偶然分支杆菌(4／41)。结论 在基因水平上较客观地了解我国目前可引起可疑肺结核症状的非结核分支杆菌的流行状况。16SrRNA基因片段序例分析鉴定非结核分支杆菌的方法快速、简便、准确并可发现一些新的菌种。

进口鱼粉和肉骨粉病原性沙门菌的分离鉴定及其16SrRNA序列的同源性分析

从进口的 17批饲料用鱼粉、肉骨粉样品中分离得到 4株细菌 ,采用生化和血清学方法鉴定 ,提取其DNA ,用细菌 16SrRNA基因通用引物进行PCR扩增 ,并对PCR扩增产物测序 ,将测定的 16SrRNA序列在NCBI数据库中进行序列同源性比较 ,确证为沙门菌 ,其中样品 2、8与鼠伤寒沙门菌的序列同源性大于 99% ,样品 10、11与伤寒沙门菌的序列同源性大于 99%。由此可以认定样品 2、8为鼠伤寒沙门菌 ,样品 10。

氯酚的生物降解特性及其微生物的16SrRNA基因序列分析

从受氯代有机物污染的土壤中富集分离到对 2 ,4 二氯酚具有高效降解能力的微生物混合菌群 .实验表明 ,降解 1mol二氯酚可以定量释放出 2mol的氯离子 .在生物流化床反应器中 ,以聚胺酯泡沫块为固定化载体吸附固定化微生物 ,进行了连续降解氯酚的实验研究 ,当水力停留时间为 2 4h ,二氯酚的初始浓度为 3 0 μmol L时 ,二氯酚的去除率均在 90 %以上 .利用平板划线法从混合微生物菌群中分离到可以利用二氯酚为唯一碳源和能源的纯种微生物 .16SrRNA基因序列分析结果表明 。

基于16SrRNA基因序列分析梅花鹿瘤胃细菌多样性

本试验旨在对以柞树叶为主要粗饲料来源的梅花鹿瘤胃细菌多样性进行分析。提取瘤胃微生物基因组DNA，扩增细菌16SrRNA基因，构建16SrRNA基因克隆文库，分析梅花鹿瘤胃细菌区系组成。结果表明：1）试验共得到107个非嵌合体16SrRNA基因序列。按照97％序列相似性，划分为22个分类操作单元（OTUs）。

大额牛瘤胃细菌16S rRNA基因序列分析

【目的】研究大额牛(Bos frontalis)瘤胃细菌16S rRNA基因序列,为揭示大额牛瘤胃细菌组成的多样性以及开发这一珍稀生物资源提供分子生物学依据。【方法】采用细菌通用引物F27和R1492对目标基因进行PCR扩增,克隆、测序后利用Neighbor-joining方法构建系统进化树。【结果】共获得147个16S rRNA基因序列,在GenBank登录号为DQ673466～DQ673612。按照97%的相似性标准,这些序列被分为86个操作分类单元。有16个序列与已培养菌的序列相似性≥97%,占总序列的10.9%;另有22个序列与已培养菌的序列相似性为90%～97%,占总序列的15%;剩余109个序列为未培养、鉴定菌,所占比例高达74.1%。系统进化分析显示,大额牛瘤胃细菌主要分布于低G+C含量细菌门(57.1%)和噬纤维菌/屈扰杆菌/拟杆菌门(42.2%),仅有一个序列位于螺旋体门。【结论】本试验获得了大额牛瘤胃细菌16S rRNA基因序列,为进一步研究大额牛瘤胃微生态系统组成及其与饲料消化之间的关系奠定了基础。

食酸代尔夫特菌16SrRNA检测及生物学特性研究

目的监测食酸代尔夫特菌的生物学特征、分子生物学特性及其与感染的关系。方法血标本培养阳性者,革兰染色阴性杆菌、球杆菌,进行形态、培养特征、细胞壁化学成分分析和16SrRNA基因测序。结果经形态学、培养特征和16SrRNA基因测序,鉴定为食酸代尔夫特菌。测定的1 418bp序列与此种菌的模式株的序列100%一致,分离菌株与模式株的生化反应有一项不同。结论本文报道食酸代尔夫特菌的53种生物学特性,为常规生化表型鉴定提供借鉴。

副溶血性弧菌16S rRNA基因序列变异规律分析

通过对副溶血性弧菌16S rRNA基因序列进行深度分析，研究其序列变异特点，为开发新的分型溯源靶点奠定基础。对111株分离自生鲜水产品的副溶血性弧菌16S rRNA基因测序，与GenBank中已有的副溶血性弧菌16S rRNA基因标准序列比对分析，对变异度比较大的序列建立了系统发育树，深入分析了基因的变异规律，并使用ERIC-PCR方法加以验证。不同副溶血性弧菌菌株16S rRNA基因变异主要集中在可变区V1和V2区，50-270 bp的区域内有38个碱基的相似度小于30%，103个碱基的相似度在30%-100%。另外，在V3区和V8区也各有1个碱基有比较明显的差异。副溶血性弧菌16S rRNA基因序列具有一定的变异性，该结果为副溶血性弧菌菌株分型溯源分析提供新的靶点奠定研究基础，同时为其微进化研究奠定理论基础。

16S rRNA序列分析法与传统生化分析法对分枝杆菌分型鉴别的比较研究

目的比较16S rRNA序列分析法与传统生化分析法鉴别54株分枝杆菌模式菌株的异同。方法采用PCR方法扩增54株分枝杆菌模式菌株16S rRNA序列,通过序列比对构建发育树状谱,计算相似性,并与传统生化分析分型结果进行比较。结果16S rRNA序列分析可鉴定出41株(41种)分枝杆菌,其它6组(包括13株11种)的分枝杆菌16S rRNA序列两两之间相同无法区别,传统的生化分析方法难以区分鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌、龟分枝杆菌和偶然分枝杆菌,但采用16S rRNA很容易区分;16S rRNA基因无法区分海分枝杆菌与溃疡分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和胃分枝杆菌,但采用传统生化分型方法很容易区分。结论在分枝杆菌的分型鉴定方面,分枝杆菌16S rRNA基因序列分析与传统分型均十分有效,且两者的联合应用,能够提高鉴定的准确性。

一株黄铜矿专属浸出细菌的分离与鉴定

从甘肃白银硫化矿区矿坑水中分离得到一株能够浸矿的细菌（命名为BY）,该菌株为革兰氏阴性细菌,短杆状,菌体的直径×长度为（0.45±0.05）μm×（1.5±0.4）μm,最适生长温度为25-30℃,最适pH值为2.0,化能自养型,能利用亚铁、单质硫和低浓度的葡萄糖生长,不能利用硫代硫酸钠、蛋白胨生长。研究结果表明：BY菌株与嗜酸氧化亚铁硫杆菌（简称A.f菌）WJ13位于系统发育树同一个分支中,相似度为99.66%,与标准A.f菌株ATCC23270的相似度为99.93%;编码区的核酸序列与报道序列（登记序列号DQ166839-DQ166841）仅差1个碱基,氨基酸序列完全一致;于30℃浸出27 d后,含菌株的摇瓶的Cu^2＋的质量浓度即达到60 mg/L,而无菌浸出时Cu^2＋的质量浓度仅为10 mg/L,表明该菌株具有应用于黄铜矿浸出的潜力。

白鳍鲨雷极氏普罗菲登斯菌的分离鉴定与药敏试验

从北京海洋馆死亡的白鳍鲨腹腔脓液和心血中分离到一株病原菌,经生理生化、培养特性、16S rRNA序列鉴定为雷极氏普罗菲登斯菌。以16S rRNA序列为基础构建了包括普罗菲登斯菌属模式株在内的系统发育树,分离菌株与雷极氏普罗菲登斯菌模式株DSM4542的同源性最近。药敏试验结果表明,该菌对氨曲南、头孢曲松、磷霉素、哌拉西林、头孢呋辛钠、诺氟沙星、头孢哌酮敏感。毒力试验结果显示该菌可致小鼠死亡。

产蛋鸡粪肠球菌的分离鉴定及药敏试验

目的:对安徽省明光市某蛋鸡养殖场3次送检的病死产蛋鸡进行病原菌的分离鉴定及药敏试验,为该病的微生物学诊断提供参考资料,为养殖户用药提供指导。方法:将3次送检的病死鸡肝脏组织进行致病菌的分离培养、生化鉴定、药敏试验、16SrRNA基因PCR扩增、序列测定、同源性分析。结果:从3次送检的病死鸡肝脏组织中分离到3株均为革兰阳性球菌,它们在麦康凯琼脂平板上均为淡红色圆形光滑湿润隆起半透明小菌落。药敏试验结果显示,该3株分离菌对多种抗菌药物均呈较强的耐药性,每株分离菌只对1种或2种药物敏感,让养殖户使用后疫情很快得到控制。对3株分离菌同源性分析结果显示,3株分离菌与粪肠球菌同源性都在98%以上。结论:该蛋鸡场3次送检的病死产蛋鸡均为感染粪肠球菌而引起的。

一株巨大芽孢杆菌的分类鉴定

基于16S rRNA序列分析和生理生化实验,对从伽师瓜病瓜上分离的一株细菌ZP-1进行了分类鉴定.结果表明,该分离菌株ZP-1与Bacillus megaterium strain PAB1C5(EU221343.1)具有99%的相似性.因此,初步推断ZP-1菌株隶属于巨大芽孢杆菌属(Bacillus magaterium).

基于高通量测序鉴定慈姑黄化病病原

【目的】明确引致广西平乐县慈姑大面积黄化的主要病原物,为该病害的防治提供参考。【方法】从广西平乐县采集自然表现褪绿黄化症状的慈姑植株,分别提取其叶片和茎组织的总RNA,利用RNA-Seq高通量测序技术对其转录组进行测序,并对序列组装获得的重叠群(contigs)进行BLAST注释,筛选出注释为植原体16S rRNA序列的contigs,根据其序列设计引物Phy-F和Phy-R,以采集的褪绿黄化症状慈姑植株和无症状植株的叶片样本总DNA为模板,进行PCR鉴定。【结果】对扩增获得的长度为1.5 kb的DNA片段进行序列测定,从分子水平证实慈姑黄化病的病原为植原体(strain:AY-China)。将测序获得的植原体16S rRNA序列与GenBank收录的15个植原体分组代表菌株的16S rRNA序列进行比对分析并构建系统发育进化树,发现AY-China与翠菊黄化植原体16SrI组(Aster yellows group:16SrI)聚类在同一分支,且各组代表菌株的16S rRNA序列相似性在88.3%～96.0%。进一步将AY-China与16SrI不同亚组代表菌株的16S rRNA序列进行多重比对并构建系统发育进化树,发现AY-China与翠菊黄化植原体16SrI-B亚组聚类到在一分支,且与16SrI-B亚组代表菌株的16S rRNA序列相似性高达99.5%,说明AY-China应属于16SrI-B亚组。【结论】广西平乐县慈姑黄化病病原为植原体,其隶属于翠菊黄化植原体16SrI-B亚组。

一株牙鲆出血症病原菌的分子生物学鉴定

从患出血症养殖牙鲆分离到一株病原菌M 4 ,革兰氏阴性 ,杆状 ,有极生和侧生鞭毛 ,能运动 ,菌落半透明。进行了常规生理生化和BIOLOG GN细菌鉴定系统测试 ,结果表明菌株M 4与V .carchariae的表型特征非常相似。为了进一步确定M 4的分类学地位 ,测定了其 16SrRNA基因序列 ,分析了相关细菌相应序列的同源性 ,构建了系统发生树 ,结果表明菌株M 4与V .carchariae的亲缘关系最近。综合上述结果 ,菌株M 4可鉴定为Vibirocarchariae。

新发现致病性产H_2S李斯特氏菌生物学特性研究

目的 对在畜间疫病流行区 ,新发现致病性产H2 S李斯特氏菌进行生物学特性研究 ,以确定其在微生物学中地位 ,为其命名提供依据。方法 从形态染色、培养特性、生化反应、抗原性方面鉴定 ,并利用分子生物学技术作DNAG +Cmol%含量测定 ,PCR、16SrRNA序列检测同源性。结果 通过表型生物学特性鉴定 ,产H2 S李斯特氏菌与已知 7型李斯特菌不同 ,其G +Cmol%为 3 0 .5 %、16SrRNA序列分析同源性与无害李斯特菌 (L .im)为 71.0 % ,灰色李斯特菌 (L .g)为 3 7.8% ,西氏李斯特菌 (L .s) 2 8.4 %。结论 经系统发育树分析 ,证实产H2 S李斯特氏菌为李斯特氏菌属 ,国际上首次报告的新种。

红树林海洋细菌的分离鉴定及其活性物质初步分析

从广西北部湾红树林海洋淤泥中分离筛选到270株海洋细菌,用喉癌细胞Hep-2的细胞毒作用为筛选模型,用SRB法检测这270株海洋细菌的抑制肿瘤细胞生长活性,其中13株呈阳性反应。依据形态和生理生化反应特征及16SrRNA基因序列分析,确定其中一株为短小芽孢杆菌Bacillus pumilusPLM4。取该菌株液体培养上清液,检测对人喉癌细胞Hep-2的生长抑制率为63.9%,经过凝胶过滤层析分析获得2个活性峰,其中活性高的峰估计平均分子量为116kd。采用经典显色反应法初步判断该活性物质为多糖。

牙鲆与大菱鲆病原迟钝爱德华氏菌生物学特性及系统发育学分析

对从7起牙鲆(Bastard halibut,Paralichthys olivaceus L.)、3起大菱鲆(Turbot,Scophthalmus maximus L.)病害的病(死)鱼中分离到的相应病原菌较系统地进行了形态特征、理化特性等表观分类学指征的鉴定及代表菌株DNA中G+Cmol%的测定.同时,择代表菌株进行了16S rRNA基因的分子鉴定,测定了16S rRNA基因序列,分析了相关细菌相应序列的同源性,构建了系统发生树.结果表明,分离鉴定的148株菌均为爱德华氏菌属(Edwardsiella Ewing and McWhorter 1965)的迟钝爱德华氏菌(E.tarda),其中128株为迟钝爱德华氏菌野生型(E.tarda wild type)菌株,20株暂定为迟钝爱德华氏菌吲哚阴性变异株.代表菌株(HC010907-1及HC010830-1)的16S rRNA基因序列,与GenBank数据库中的迟钝爱德华氏菌的同源性均在99%.

我国近海中度嗜盐菌的分离筛选及其产酶多样性分析

为了解我国近海中度嗜盐菌系统发育多样性及产酶特性，从天津、山东、江苏、福建、海南等地近海采集样品为研究对象，分离筛选得到108株中度嗜盐菌，其中有26株至少产一种酶。通过对其形态特征、生理生化、16S rRNA 基因序列及系统进化树进行分析，将26株菌鉴定为细菌域的Halomonas、Idiomarina、Virgibacillus、Pontibacillus、Oceanobacillus、Halobacillus和 Marinilactibacillus属的菌株。它们与相应属的模式菌株16S rRNA基因序列相似性在97％～100％不等，其中有些菌株可能代表不同的分类单元。底物特异性试验表明，分离的26株中度嗜盐菌13株产蛋白酶，19株产淀粉酶，13株产酯酶，4株产纤维素酶。其中6株产3种酶，11株产2种酶。研究结果表明中度嗜盐菌具有系统发育和产酶多样性，同时蕴藏着较多新的微生物类群，为嗜盐微生物资源应用开发提供了参考。

用探针杂交法检测鸡毒支原体和滑液囊支原体

根据鸡毒支原体(MG)和滑液囊支原体(MS)的16SrRNA基因序列,设计并合成了探针MG和MS共同目的基因,跨幅为580bp的一对引物。用这对引物对2个标准的MG和1个标准的MS菌株DNA模板进行聚合酶链反应(PCR),结果得到了预期大小约580bp的PCR产物。回收纯化琼脂糖电泳凝胶中的MG扩增产物克隆至T载体中,DIG随机引物法合成核酸探针,斑点杂交试验对MG和MS均呈阳性,检测灵敏度分别为2ng和3ng,其它对照菌(毒)株为阴性。