3β-乙酰氧基雄甾-5,15-二烯-17-酮的合成

以醋酸去氢表雄酮为原料,经C17保护,C16溴代,C15和C16间脱溴化氢及C17脱保护4步反应法合成了3β 乙酰氧基雄甾 5,15 二烯 17 酮。探讨了影响缩酮化反应、溴代反应、消除反应及去保护反应的主要因素,测试了各步产物的物理常数,并用高效液相色谱,红外光谱,质谱,氢核磁共振等对产物进行了表征。研究结果表明:缩酮化反应中催化剂对甲苯磺酸与甾体的量比为0.066时比较适宜,过量会产生油状物;溴代反应中,溴化试剂C5H5N·HBr·Br2的性能优于Br2的性能;溴代反应中间体偕二溴代物中,脱溴试剂NaI的性能优于KI的性能,KI的性能优于Zn粉的性能;消除反应中反应速度与叔丁醇钾的用量成正比,溶剂二甲亚砜优于二甲苯;升高温度不利于去保护反应的进行。上述4步反应的收率分别为93.4%,81.8%,88.8%和96.7%,总收率为65.6%。

3β-羟基雄甾-5,15-二烯-17-酮的合成

目的研究 3β 羟基 雄甾 5 ,15 二烯 17 酮的合成方法。 方法以去氢表雄酮为原料 ,经过溴代、缩酮化、脱溴化氢、脱缩酮保护基反应得到目标产物 ,总产率 32 1%。结果与结论合成路线简便易行 ,适于大规模制备。

17α,21-二羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-17-戊酸酯的合成

以雄烯二酮为起始原料,经加成、硅醚化、环加成-质子脱硅基化及置换等7步反应合成了氢化可的松的中间体——17α,21-二羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-17-戊酸酯,总收率75%,纯度>96%,其结构经1H NMR和ESI-MS确证。

11α,17-二羟基-及11β,17-二羟基-雄甾-1,4-二烯-3-酮-17-腈羟基保护的研究

11α ,17 二羟基 及 11β ,17 二羟基 雄甾 1,4 二烯 3 酮 17 腈以乙烯基正丁醚进行保护 ,得到双羟基和 11 及17 单羟基保护产物 ,对因保护基引入手性碳而产生的双羟基保护产物的立体异构体进行了分离纯化和波谱鉴定 ;

3β-乙酰氧基-15β,16β-亚甲基雄甾-5-烯-17-酮的合成

在二甲亚砜、四氢呋喃或1,4—二氧杂环己烷溶剂中,当温度为12～30℃时,碘化三甲氧硫锤钅翁((CH3)3S+OI-)与氢化钠(NaH)作用1h生成甲基硫氧叶立德,再与3β 乙酰氧基雄甾 5,15 二烯 17 酮(Ⅱ)反应,产物经分离得到环丙化产物3β 乙酰氧基 15β,16β 亚甲基雄甾 5 烯 17 酮;探讨了反应物配比、反应温度、溶剂种类、加料方式对环丙化反应的影响.当反应温度为12℃,n((CH3)3S+OI-)∶n(NaH)∶n(Ⅱ)=1.10∶1.05∶1.00,加料方式为叶立德溶液加入到甾体溶液中,溶剂为二甲亚砜和四氢呋喃(体积比为4∶1)时,用重结晶法分离得产物,产率为80.5%.测试了产物的比位移值Rf、熔点、旋光度,并采用IR,MS和1HNMR等对产物进行了表征.

DMAP催化的17β-氰基-17α-羟基雄甾-4-烯-3-酮硅醚化反应研究

以4-二甲氨基吡啶(DMAP)为催化剂,氯甲基二甲基氯硅烷(CDCS)为硅醚化试剂,Et3N为缚酸剂,5℃反应2 h,对17β-氰基-17α-羟基雄甾-4-烯-3-酮(I)的17α-OH进行硅醚化保护,生成17β-氰基-17α-羟基雄甾-4-烯-3-酮-17-氯甲基二甲基硅醚(II)。研究水分、p H、DMAP用量及投料顺序对化合物(I)硅醚化反应的影响。在最佳反应条件下,化合物收率98.70%,纯度99.07%。

高效液相色谱-质谱联用法分析微生物降解植物甾醇为雄甾烯酮

采用高效液相色谱-质谱联用法(HPLC/MS)分析测定植物甾醇侧链降解过程中产物雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)及雄甾4-烯-3,17-二酮(AD)。其中液相色谱的条件为色谱柱AlltimaC18ODS-2(5μm,250mm×4.6mm);流动相甲醇:水(V/V=7:3);流速1mL/min;柱温室温;紫外检测器的检测波长244nm。质谱为ZMD Micromass电喷雾质谱仪。结果测得ADD与AD标准样品的保留时间分别为9.70min与11.13min,发酵样品的HPLC与MS图谱与ADD与AD标准样品的图谱一致。采用高效液相色谱法定量ADD与AD的线性范围在0.01mg/mL^0.09mg/mL,产物回收率分别为102.6%与105.90%,日内精密度分别为3.02%与3.08%,日间RSD分别为3.50%与3.24%。该方法灵敏度高、选择性好、操作简便、定量准确,适用植物甾醇微生物侧链降解过程中产物的分析及产品质量控制。

菌株Bacillus sp ST06-95转化植物甾醇为雄甾烯酮发酵条件的优化

利用本研究室筛选获得的Bacillus sp ST06-95为出发菌株,对植物甾醇进行选择性侧链降解制备雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)。对转化条件如底物浓度、投料方法、投料时间进行了摸索,对发酵初始pH、转化时间、发酵温度、接种量、培养基组成等进行了优化。结果表明,用0.4%的Tween80配合超声波溶解、底物浓度为0.5%、菌体未生长时投加底物转化效果最佳。最佳发酵条件为:初始pH7.0、接种量12%、发酵温度30℃、发酵时间160h,发酵培养基中甘油与葡萄糖的含量为1∶4。在最佳转化条件下产物ADD与AD的得率从优化前的29.5%提高到42.5%,其中ADD与AD的含量比值大约为4∶1。

一株高效转化Phytosterol为雄甾烯酮菌株的筛选与鉴定

从保藏的200多株菌中筛选出1株高效转化植物甾醇为4-烯-雄甾-3,17-二酮和1,4-二烯-雄甾-3,17-二酮的菌株,并对该菌进行了形态、生理生化的研究。结果发现菌株ST06可以利用多种碳源,可以水解淀粉,但不利用纤微素。用16SrDNA的方法对其进行鉴定,发现与Bacillus属Bacillus amyloiquefaciens的相似性最高,达到99.9%,将该菌株命名为Bacillus amyloiquefaciens ST06。该菌在培养温度30℃,pH7.0,转速220r/min,转化时间7d,底物添加量为0.3%时,ADD与AD的总得率高达40%以上,此时底物转化率高达93.7%。

Gibberella intermedia C2转化4-雄甾烯-3、17-二酮的研究

甾体化合物具有独特的生理活性,已被广泛应用于抗炎、利尿、免疫、避孕及抗癌等领域。近些年,生物催化与转化在甾体药物中间体合成中发挥的作用日益强大。为了能够合成一些具有潜在价值的新型甾体化合物,以实验室菌种库中保藏的一株Gibberella intermedia C2为研究对象,选取了雄甾烷中一种有广泛用途的化合物4-雄甾烯-3、17-二酮(简称雄烯二酮,AD)为底物进行生物转化。转化液经提取分离,最终获得2个转化产物,经结构鉴定分别为15α-OH-AD和11α,15α-diOH-AD。转化机制研究发现,G.intermedia C2先将底物的15位羟基化生成15α-OHAD,再将其11位羟基化形成双羟基产物。赤霉菌能够特异性、有序地完成对AD的两步羟化反应。此外,通过工艺优化,确定了羟化4AD反应的最适工艺参数如下:发酵培养基的初始pH 6.5,装液量30ml/250ml,底物浓度6.0g/L,转化温度28℃,摇床转速220r/min,转化周期为84h。此时,底物AD的摩尔转化率达到81.5%。

氢化可的松中间体-孕甾-4-烯-17α,21-二醇-3,20-二酮-21-醋酸酯的合成

目的:以雄烯二酮(AD)为原料合成氢化可的松中间体。方法:从AD出发,通过醚化保护,Wittig反应,KMnO4氧化,Py.SO3氧化合成氢化可的松中间体孕甾-4-烯-17α,21-二醇-3,20-二酮-21-乙酸酯。结果:C17位引入侧链基团。结论:该方法合理,合成路线短,反应条件温和,适宜工业化生产。

表达3-甾酮-△^(1)-脱氢酶降解植物甾醇合成雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮

构建分枝杆菌表达载体pMTac并在分枝杆菌Mycobacterium neoaurum JC-12中加强表达甾醇降解过程中的关键酶3-甾酮-△1-脱氢酶(KSDD)以提高雄甾-1,4-二烯-3,17-二铜(ADD)的产量。将p MF41的启动子pACE替换成tac启动子构建载体pMTac,在分枝杆菌中分别表达报告基因绿色荧光蛋白(GFP)和关键酶KSDD,通过GFP亮度和KSDD酶活验证tac启动子在M.neoaurum JC-12中的效果,并发酵验证加强表达KSDD对产物ADD的影响。荧光显微照片表明两个载体均能在M.neoaurum JC-12表达GFP,但tac启动子的效果比pACE强。酶活测定结果为重组菌M.neoaurum JC-12/pMTac-ksdd破碎细胞上清液中KSDD酶活比原始菌提高了6.53倍,比M.neoaurum JC-12/pMF41-ksdd提高了4.36倍。摇瓶发酵显示重组菌M.neoaurum JC-12/pMTac-ksdd ADD的产量比原始菌提高了22.2%,由4.86 g/L提高到5.94 g/L,而AD的产量由0.92 g/L减少到0.17 g/L,降低了81.5%;与M.neoaurum JC-12/p MF41-ksdd比,ADD产量提高了12.7%,AD降低了71.2%。以20 g/L植物甾醇为底物,5 L发酵罐中重组菌M.neoaurum JC-12/pMTac-ksdd的ADD产量达到10.28 g/L。结果表明,构建的新型表达载体pMTac适用于在M.neoaurum JC-12中加强表达关键酶KSDD,而且在M.neoaurum JC-12中过量表达KSDD有助于ADD产量的提高,为目前报道的发酵法利用新金色分枝杆菌降解植物甾醇合成ADD的最高水平。

黑曲霉催化雄甾-4-烯-3,17-二酮16β-羟基化

为进一步确定黑曲霉菌株TCCC41650的生物转化能力,以雄甾-4-烯-3,17-二酮(Androstenedione)为底物,利用黑曲霉菌株TCCC41650进行催化,产物经纯化、重结晶后,通过单晶衍射鉴定为16β-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮。转化条件为:培养液pH 6.0,乙醇添加量为2%,投料浓度为1‰时,72 h转化率为85.8%。目前甾体研究领域对于C16β-羟基化的微生物转化未见报道,研究结果为C16β-羟基甾体药物的研发奠定了基础。

耻垢分枝杆菌中3-甾酮-Δ1-脱氢酶对植物甾醇转化积累9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮的影响

9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)是一种重要的甾体药物中间体,分枝杆菌转化植物甾醇的过程中,9α-OH-AD的分解是导致其产率降低的一个关键因素,之前的研究已表明,3-甾酮-Δ1-脱氢酶(3-ketosteroid-Δ1-dehydrogenase,KstD)在9α-OH-AD的分解过程中起着重要的作用.耻垢分枝杆菌mc^2155(Mycobacterium smegmatismc^2155)菌株基因组中存在6个编码3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因,通过对这6个脱氢酶基因分别进行外源表达和活性测定,发现只有KstD1、KstD2和KstD3具有脱氢活力;使用CRISPR-Cas12a辅助重组技术成功构建了失活kstD1、kstD2和kstD3的菌株,结果显示单独失活基因kstD1能够产生9α-OH-AD,但随着转化时间的延长,9α-OH-AD会降解,无法积累,同时失活kstD1、kstD2和kstD3的菌株以5 g/L植物甾醇为底物时,转化14 d内9α-OH-AD能够稳定存在,产物浓度达到2.86 g/L.可见,耻垢分枝杆菌mc^2155中kstD1基因对9α-OH-AD积累起关键作用,随着转化的进行和产物的积累,kstD2和kstD3的作用逐渐显现,同时失活3个3-甾酮-Δ1-脱氢酶有效提高了菌种生产9α-OH-AD的稳定性和产率,本研究结果可为构建9α-OH-AD生产菌种及产业化应用奠定基础.(图6表5参30)

微生物发酵法生产去氢表雄酮检测方法的建立

建立了一个微生物发酵生产去氢表雄酮（DHEA）的检测方法,采用气相色谱法同时测定发酵液中雄甾-4-烯-3,17-二酮（4-AD）、去氢表雄酮甲氧基甲基醚和DHEA含量。发酵液经乙酸乙酯萃取,可直接进样分析。气相色谱条件为：FID检测器,DB-1型（30 m×0.53 mm×0.25 m）毛细管柱;柱温280℃,进样口280℃,检测器310℃;载气为高纯N2,流速1 m L/min。在实验室条件下,发酵液中各主要成分分离情况良好。结果表明：4-AD、去氢表雄酮甲氧基甲基醚和DHEA的浓度线性范围分别为：4-AD为0.2~1.0 g/L（R2=0.996）;去氢表雄酮甲氧基甲基醚为0.1~0.9 g/L（R2=0.992）;DHEA为0.2~1.0 g/L（R2=0.998）,平均回收率依次为（97.88±0.74）%,（99.39±1.07）%和（98.91±1.09）%。该方法具有步骤简单,重现性好,准确度和灵敏度高的特点。

雄甾-4-烯-3,17-二酮(4-AD)转化菌种的筛选及鉴定

从土壤中筛选能将植物甾醇转化为雄甾-4-烯-3,17-二酮(4-AD)的菌种。采用富集培养基富集能降解植物甾醇的菌种、采用摇瓶进行发酵、采用薄层层析的方法对发酵产物进行检测、采用高效液相方法测定发酵液中4-AD的含量、采用PCR方法扩增菌种的16S rDNA序列。筛选出了一株转化能力最强的菌株,命名为:3-12。将这株菌的16S rDNA序列与GeneBank中收载的序列进行比对,3-12号菌株为分支杆菌。

油水双相体系中分枝杆菌降解植物甾醇产9-羟基雄烯二酮的工艺

9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9-羟基-雄烯二酮,9α-OH-AD)是一种重要的甾体药物中间体,主要用于糖皮质激素类和性激素类药物的生产,可由微生物转化法降解植物甾醇而得.植物甾醇在水中的溶解度极低,生物可利用度不高,严重制约了微生物对植物甾醇底物的利用效率.为进一步提高目的产物9α-OH-AD的摩尔得率,以前期诱变筛选的Mycobacterium sp.LY-1作为出发菌株,考察不同HLB值的表面活性剂对9α-OH-AD摩尔得率的影响,筛选得到最适表面活性剂,并建立高效的油水转化体系(油水体系的HLB=7.3).结果表明,HLB值为15的表面活性剂Tween-80有利于提高9α-OH-AD的摩尔得率,当添加4.0 g/L Tween-80时,9α-OH-AD的摩尔得率达到38.5%.在该工作基础上,发现添加促溶剂100.0 g/L的大豆油对分枝杆菌转化植物甾醇生成9α-OH-AD具有促进作用.同时,添加4.0 g/L Tween-80和100.0 g/L大豆油时,当植物甾醇质量浓度为30 g/L时,9α-OH-AD摩尔得率为36.9%,9α-OH-AD质量浓度达到8.17 g/L,较对照提高了324.1%.本研究表明建立的油水转化工艺体系在一定程度上增加了底物质量浓度,提高了菌体的转化能力,结果可为甾醇生物转化体系的研究提供重要的参考信息.

一株分枝杆菌降解胆固醇制备AD(D)的转化条件

通过分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)M3限制性降解胆固醇侧链获得了产物雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)。优化了胆固醇的投料时间、投料方式、培养基初始pH和葡萄糖浓度等工艺参数。将羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)应用于转化反应中,确定了HP-β-CD的最佳添加时间和添加量,使AD(D)生成率由初始对照的30%提高到60%,转化至72 h时AD(D)生成率达48%,是同期对照的4.0倍,生成率与生成速率均得到显著提高。在添加HP-β-CD的最佳转化条件下,AD(D)生成率达到70%,是初始对照的2.3倍。

螺甾内酯(Spiroenone)中间体的合成

3β 乙酰氧基雄甾 5,15 二烯 17 酮(2)与甲基硫氧叶立德(3)通过亲核加成反应得到螺甾内酯(Spiroenone)重要中间体3β 乙酰氧基 15β,16β 亚甲基雄甾 5 烯 17 酮(1),产物经重结晶法分离,收率达80.5%.讨论了反应的主要影响因素,找到了优化条件,即反应温度为12℃,n((CH3)3S+OI-)∶n(NaH)∶n(2)=1.1∶1.05∶1,溶剂为二甲亚砜和四氢呋喃(体积比为4∶1)时,加料方式为叶立德溶液加入到甾体溶液中.实验表明:低温有利于15β,16β 亚甲基产物的形成.测试了产物的物理常数;并用IR,MS,1HNMR等波谱分析手段对产物进行了表征.

Mycobacterium sp.LY-1高效转化植物甾醇两相体系的构建

9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)是一种卤代皮质类激素的重要前体,具有重要的商用价值.为进一步提高目的产物9α-OH-AD的产量,在本实验室前期利用非离子表面活性剂壬基酚乙氧乙烯醚(TX-40)替代大豆油进行Mycobacterium sp.LY-1转化植物甾醇的基础上,通过考察16种助溶剂与TX-40复配对菌株LY-1转化植物甾醇生产9α-OH-AD的影响,确定最适助溶剂为司盘-20.通过正交优化实验确定司盘-20的最优添加浓度为0.1%.进一步考察不同浓度细胞膜结构抑制剂甘氨酸、鱼精蛋白、异烟肼对菌株LY-1转化植物甾醇的影响,结果显示在以上转化体系中添加1.0μg/mL的鱼精蛋白时,9α-OH-AD的摩尔得率最高,达到46.4%.最终确定菌株LY-1降解植物甾醇的两相转化体系为TX-400.7%,司盘-200.1%,鱼精蛋白1.0μg/mL.该体系于植物甾醇的投料浓度提高至35 g/L时,目的产物9α-OH-AD的摩尔得率仍能稳定在32.5%以上.本研究成功构建了Mycobacterium sp.LY-1高效转化植物甾醇的两相体系,结果可为其工业化应用奠定良好基础.(图4表2参26)