单葡萄糖醛酸甘草次酸高效生物制备菌种筛选及发酵工艺

甘草中含量较少的三萜类成分单葡萄糖醛酸甘草次酸(GAMG)在药品、食品和化妆品领域具有较高的应用价值。生物制备法具有污染小、反应条件温和、底物特异性高和副产物少的优点。为改善GAMG的制备工艺,本研究对甘草产地根际土壤中菌种进行单一碳源平板初筛和液态发酵复筛,选育了可将甘草酸(GL)转化为GAMG的高效转化菌株土曲霉菌(TMZ05),并结合单因素实验及正交试验优化发酵工艺,最终确定其最优发酵工艺条件:底物质量浓度5 g/L、种子液菌丝体接种量40个、发酵温度30℃、发酵液初始pH 6、发酵时间3 d。在最优发酵工艺条件下,GAMG最高摩尔收率可达62.34%;β-葡萄糖醛酸苷酶酶活最高可达307.14 U/mL。

水／离子液体[BMIM]PF6两相体系中全细胞催化生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸

研究了水/离子液体两相体系中重组毕赤酵母Pichia pastoris GS115(r-PGUS-P)全细胞转化甘草酸(GL)生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)的反应。确定最适反应体系为离子液体[BMIM]PF6/水(2∶8,体积比),最适缓冲液pH、反应温度、底物浓度和细胞加入量分别为5.4、45℃、6.0mmol.L-1和8.0g.L-1。在此条件下反应58h,产物GAMG得率和化学键选择性分别为69.6%和67.2%,与纯水相反应体系相比,分别提高了12.4%和12.61%。离子液体循环使用7次后,回收利用率为93.47%。产物GAMG和副产物甘草次酸(GA)在此两相体系中得到有效分离,为后续产物分离带来便利。

固定化细胞连续生产单葡萄糖醛酸基甘草次酸

产紫青霉菌株(Penicillium purpurogenum Li-3)能定向转化甘草酸(GL)为单葡萄糖醛酸基甘草次酸(glycyrrtinic acid 3-O-mono-β-D-glucuronide,GAMG),针对课题组前期海藻酸钙包埋产紫青霉Li-3的珠体机械强度不高,操作使用性能低等问题,通过添加天然物质和化学处理改变凝胶结构,提高改性海藻酸钙珠体的机械强度,并考察了改性海藻酸钙固定化细胞的催化性质。利用改性海藻酸钙固定的产紫青霉(Penicillium purpurogenum Li-3)微球在具有隔离筛的改进型填充床反应器中连续转化甘草酸(GL)生产单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)。结果表明添加4%的硅藻土能够改善固定化细胞微球的机械强度,提高了反应的转化率。改性前后的固定化细胞微球的最适p H值和最适温度均未发生变化,但改性的固定化细胞反应转化率与对照相比分别提高了22%和30%。向底物中添加0.12%的吐温-80能进一步使GAMG的产量提高44%。同时,改性的固定化细胞微球具有较好的贮存稳定性和重复使用性。最后利用改性固定化细胞微球在具有隔离筛的改进型填充床反应器内实现了连续生产GAMG,在最佳反应条件下,GAMG的产量为0.193 g/(L·d),GL的转化率为34%,时空产率约为13.7μmol/(L·h)。利用改性固定化细胞微球在改进型的填充床反应器内进行连续反应生产GAMG,为建立高效全细胞转化甘草酸合成GAMG的反应体系奠定了基础。

响应面设计法优化单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)发酵转化培养基

以甘草酸(glycyrrhizin,GL)为底物,利用产紫青霉(Penicillium purpurogenum Li-3)液态发酵转化单葡萄糖醛酸甘草次酸(GAMG),采用响应面设计法对初始发酵培养基进行优化。用部分因子分析法研究原始发酵培养基各成分对响应值的显著程度,发现甘草酸(GL)、NaNO3和K2HPO4的质量浓度对发酵产生GAMG的影响显著(P<0.01)。用中心组合设计确立甘草酸、NaNO3和K2HPO4的适宜质量浓度分别为2.8、3.0和0.8 g/L。在优化条件下进行发酵时,GAMG的转化率从75.49%提高到89.11%,比优化前提高了13.62%。

产单葡萄糖醛酸甘草次酸菌株的筛选及发酵条件的优化

从甘草土壤中筛选纯化得到一株产β-D-葡萄糖醛酸苷酶(β-D-glucuronidase,β-GUS)的菌株,采用常温室压等离子体诱变技术(ARTP)对原始菌株进行诱变,筛选得到高产突变菌株。经传代10次培养验证该菌株遗传性状稳定。通过菌落形态、显微镜制片观察和ITS序列比较确定菌株为蓝状真菌属,命名为Talaromyces sp.02。对其进行发酵产酶优化,确定发酵产酶的工艺。结果表明,以5 g/L的甘草酸为诱导剂,3 g/L的硝酸钠为氮源,初始p H 5.5,发酵温度30℃,10%的接种量,发酵144 h,在此条件下,该菌株可水解甘草酸(Glycyrrhizin,GL)生成单葡萄糖醛酸甘草次酸(Glycyrrhetinic acid monoglucuronide,GAMG),产量可达4.03 g/L,且几乎无副产物甘草次酸的生成,其发酵产率可达到87.88%,葡萄糖醛酸苷酶的酶活为162.20 U/m L,是原始复筛菌株的3.23倍,是一株具有开发前景和应用潜力的葡萄糖醛酸苷酶生产菌株。

甘草酸转化单葡萄糖醛酸甘草次酸中催化酶的选择

甘草酸是甘草药材中的重要药用成分,将甘草酸定向转化成单葡萄糖酸甘草次酸可以提高其药物活性降低毒性。制备新鲜猪肝脏匀浆,离心切取肝脏溶酶体作为转化催化剂,通过紫外-分光光度法对反应产物进行分析,证实反应生成了单葡萄糖醛酸甘草次酸,几乎不生成甘草次酸,说明溶酶体选择性较高。

甘草酸酶催化水解单葡萄糖醛酸甘草次酸的反应溶剂研究

甘草酸(GL)是甘草类中药材中的有效成分,将甘草酸转化为单葡萄糖酸甘草次酸(GAMG)可以提高其药物活性并降低生物毒性。离心切取新鲜猪肝脏匀浆中间段溶酶体作为酶催化剂,用胆碱基深共晶溶剂作为反应溶剂进行酶催化水解反应,用紫外-可见分光光度法对反应产物进行分析,比较了两种介质下的反应转化率。

水/有机溶剂体系中产紫青霉全细胞催化合成单葡糖醛酸基甘草次酸

研究了产紫青霉Penicillium purpurogenum Li-3全细胞β-D-葡萄糖醛酸苷酶在水/有机溶剂体系中催化水解甘草酸,合成单葡糖醛酸基甘草次酸(GAMG)的反应。确定了最适反应体系为水/叔丁醇(体积比为3∶7),最适反应条件为:底物甘草酸用量1.5g·L-1、反应温度45℃、pH值5.0、全细胞酶量7g·L-1、摇床转速120r·min-1,在此条件下反应48h,产物GAMG产率可达79.12%,全细胞酶具有较好的稳定性和可重复使用性,显示了良好的应用前景。

亲水性离子液体[EMIM]BF_4对固定化β-葡萄糖醛酸苷酶催化活性的影响

以壳聚糖为固定化载体,采用吸附交联法制备固定化β-葡萄糖醛酸苷酶;以1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([EMIM]BF4)/缓冲溶液均相体系为介质,研究了亲水性离子液体[EMIM]BF4对固定化酶生物催化甘草酸(GL)合成单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)的影响.实验结果表明,当均相体系中[EMIM]BF4的体积分数为16%,pH为5.4,反应温度为50℃及摇床转速为200 r/min时,酶活力达到最高,并且明显优于纯缓冲溶液体系中的最高酶活.重复利用性实验结果表明,与纯缓冲液介质体系相比,固定化酶在含亲水性离子液体[EMIM]BF4的均相介质中表现出较好的操作稳定性.表观动力学参数和活化能数据表明,亲水性离子液体[EMIM]BF4在催化体系中能够增强酶和底物GL的亲和力,有效稳定酶-底物的过渡态,并降低反应活化能,而使固定化β-葡萄糖醛酸苷酶表现出较高的催化活性.

极耐热性β-葡萄糖醛酸酶的高效表达和酶学性质及其应用

从海栖热袍菌克隆出编码热稳定性β-葡萄糖醛酸酶基因,以热激载体pHsh为表达质粒,在大肠杆菌中得到高效表达。基因表达产物通过一步热处理后,酶纯度达电泳均一。纯化重组酶酶学性质研究表明,β-葡萄糖醛酸酶的最适反应温度为80oC,最适反应pH为5.0,pH5.8～8.2之间酶的稳定性较好,80oC的半衰期为2h,SDS-PAGE结果显示分子量为65.9kD,与理论推算值相吻合。以对硝基苯-β-葡萄糖醛酸苷(pNPG)为底物时,其动力学参数Km值0.18mmol/L,Vmax值为312u/mg。初步的应用分析表明,该重组酶能催化甘草酸转化为甘草次酸。

反相高效液相色谱法同时测定甘草酸及其酶转化产物

甘草酸（glycyrrhizic acid，GL）及其衍生物是一类具有重要生理活性的化合物。利用酶转化GL可以生成具有更高生理活性的单葡萄糖醛酸甘草次酸（glycyrrhetyl 3-O-mono-β-D—glucuronide，GAMG）。为了深入研究该酶对GL的生物转化特性，该文建立了一种能同时检测GL及其酶转化产物GAMG的高效液相色谱分析方法。采用Apollo C18分析柱，流动相V（甲醇）：V（水）：V（冰醋酸）=75：25：5，流速1．0mL／min，紫外检测波长254nm。在进样量为0．2—20μg内成良好的线性关系，GL的加样回收率为94．3％-103．2％，相对标准偏差为0．85％-2．53％；GAMG的加样回收率为92．6％-98．7％，相对标准偏差为1．45％-3．25％。方法准确、简捷、耗材低廉。

离子液体[BMIM]BF_4对甘草酸及其衍生物色谱行为的影响

将离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（[BMIM]BF。）加入到高效液相色谱流动相中，研究其对甘草酸（GL）及其衍生物甘草次酸（GA）和单葡萄糖醛酸基甘草次酸（GAMG）色谱行为的影响。结果显示，加入离子液体后的流动相能够明显改善色谱峰形、减少峰拖尾、增大峰面积和峰高、提高检测灵敏度，并缩短GL，GA及GAMG3种化合物的同时检测时间，提高检测效率。优化色谱条件为：InertSustain C18（4．6mm×250mmi．d．，5μm）反相色谱柱为分离柱，柱温40℃；甲醇-1．0mmol／L[BMIM]BF4（体积比81：19，乙酸调至pH3．0）为流动相，流速0．7mL／min，进样体积20μL，检测波长251nm。GL，GA及GAMG在5．00—100mg／L范围内线性关系良好（r≥0．9998），检出限分别为0．02，0．04，0．09mg／L；加标回收率分别为100．1％，98．0％，98．2％，RSD为0．18％～0．43％。同时测定GL生物转化体系中3种组分，结果满意。

重组β-葡萄糖醛酸苷酶键选择性的半理性改造

为了提高Escherichia coli重组表达的β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS-E)的键选择性,本研究以PGUS-E结构与功能关系的推测为指导,选择了可能影响PGUS-E的键选择性的R329、T369、N467位点进行定点饱和突变,利用薄层层析(TLC)和高效液相色谱(HPLC)对键选择进行筛选,得到优势突变酶R329K、T369V。结果显示:与PGUS-E酶相比,突变酶R329K、T369V键选择性分别提高26.9%、34.3%。突变酶的酶学性质研究表明,突变酶的最适p H和温度与PGUS-E一致,但其酶催化效率下降。由此可见,R329、T369对酶催化的键选择性和酶的活性有显著影响。综上结果,本文应用饱和突变方法改善了PGUS-E的键选择性,为酶的结构和功能关系理解提供了实验依据。

甘草皂苷类化合物结构与保肝活性关系的DFT研究

三萜皂苷类化合物是中药甘草保肝作用的主要药效物质。本文以甘草中的三种皂苷类化合物甘草酸、单葡萄糖醛基甘草次酸和甘草次酸为研究对象,采用密度泛函理论方法(DFT)在B3LYP/6-31+G*水平上,对三萜皂苷类化合物进行量子化学计算。依据化合物的几何结构、NPA电荷、偶极矩、溶剂化能和前线轨道能等参数,分析甘草中皂苷类化合物的结构与保肝活性之间的关系,以期对中药甘草的深入研究与开发提供理论基础。计算结果表明,三种甘草皂苷类化合物的活性部位在五环三萜上,而糖环不是其药理活性部位,但是糖环的结构和数目会影响药物分子的理化性质。根据前线分子轨道能级之差ΔE值可知,三种化合物的保肝活性顺序为:GA>GAMG>GL。

固芯液化技术对微囊化Penicillium purpurogenum Li-3细胞使用性能的影响

以微囊化产紫青霉细胞(Penicillium purpurogenum Li-3)催化甘草酸(GL)定向合成具有更高生物利用度、甜度以及安全性的单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)为目的,研究固芯液化技术对微囊化细胞使用性能的影响。结果显示,液芯微囊化细胞的生长情况和传质性能明显优于固芯微囊化细胞,并在第1批次催化反应中,液芯微囊化细胞的相对活性达到98.7%,比固芯微囊化细胞(72.7%)要高。9批次重复利用实验表明,与固芯微囊化细胞相比,液芯微囊化细胞的相对活性较高,而机械强度和操作稳定性要稍显逊色。此外,固芯液化的技术与条件对微囊化细胞发挥最佳催化效果至关重要。

微囊化Penicillium purpurogenum Li-3细胞的制备及其催化性能研究

采用海藻酸钠(SA)-羧甲基纤维素钠(CMC)液芯微胶囊技术制备微囊化产紫青霉细胞(Penicillium purpurogenum Li-3),研究其制备条件及其催化性能,考察不同因素对微囊化细胞直径、机械强度、破损率、催化活性的影响。结果表明,在羧甲基纤维素钠的浓度为1.4%、海藻酸钠的浓度为1.2%、Ca Cl2的浓度为1.0%、固化过程Ca Cl2浓度为0.5%及加菌量为3.0%的条件下,制得的微囊化细胞在重复利用9次后,相对活性仍达到56.9%,显示出较好的机械强度和操作稳定性。本文为高效生物转化甘草酸合成单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)提供了技术支持。

高效液相色谱法同时测定甘草酸及其发酵产物

建立甘草酸发酵液中甘草酸及其发酵产物乌拉尔甘草皂苷乙、3-O-β-D-葡萄糖醛酸-24-OH-18β-甘草次酸、单葡萄糖醛酸甘草次酸、18α-单葡萄糖醛酸甘草次酸和甘草次酸的RP-HPLC含量测定方法,为单葡萄糖醛酸甘草次酸的生产工艺研究及产品质量控制提供方法学基础。采用Kromasil C18（250 mm×4.6 mm,5μm）色谱柱,以甲醇（B）-1%乙酸溶液（A）为流动相进行梯度洗脱：0 min,63%B;40 min,66%B;50 min,75%B;70 min,90%B;80 min,90%B。体积流速：1.0 mL/min;进样量：10μL;柱温：25℃;检测波长：254 nm。甘草酸、乌拉尔甘草皂苷乙、3-O-β-D-葡萄糖醛酸-24-OH-18β-甘草次酸、单葡萄糖醛酸甘草次酸、18α-单葡萄糖醛酸甘草次酸和甘草次酸的线性范围分别为11.25-180.0μg/mL（r=0.9986）;3.031-96.99μg/mL（r=0.9978）;2.595-83.00μg/mL（r=0.9999）;62.50-2000μg/mL（r=0.9999）;11.25-180.0μg/mL（r=0.9980）;1.560-50.00μg/mL（r=0.9992）;平均回收率（n=9）分别为98.3%,101.2%,98.4%,101.9%,101.7%,97.42%,RSD分别为2.5%,1.4%,0.96%,2.8%,0.73%,0.32%。

双三氟甲烷磺酰亚胺类离子液体对产紫青霉菌株全细胞催化特性的影响

研究了双三氟甲烷磺酰亚胺阴离子Tf_2N^-分别与5种不同阳离子组成的离子液体对产紫青霉菌(Penicillium purpurogenum Li-3)的生长、代谢、细胞膜透性及全细胞催化活性的影响.结果表明,[N_(1,4,4,4)]Tf_2N对产紫青霉菌的生长有促进作用,[Py_(14)]Tf_2N,[Bmim]Tf_2N,[BPy]Tf_2N和[P_(6,4,4,4)]Tf_2N 4种离子液体对产紫青霉菌的生长则均有不同程度的抑制.代谢活力保留值R的测定结果表明,[P_(6,4,4,4)]Tf_2N和[N_(1,4,4,4)]Tf_2N对产紫青霉菌体细胞表现出相对较高的生物相容性;5种离子液体对菌体细胞的细胞膜透性均有改善作用.全细胞催化反应数据显示,最优离子液体为[P_(y14)]Tf_2N,当其加入量为25%,反应84 h后,单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)产率高达95.38%.5种离子液体对产紫青霉菌的生长、代谢、细胞膜透性及全细胞催化活性的影响不仅与阴离子Tf_2N^-有关,阳离子的组成、结构和性质也发挥重要的作用.

聚氨酯泡沫法固定化Penicillium purpurogenum Li-3细胞

以聚氨酯泡沫为化载体,采用吸附法将产紫青霉Penicillium purpurogenum Li-3细胞进行固定化。试验表明:聚氨酯泡沫立方体颗粒尺寸为6 mm、加入量为2%时GAMG产量最高,可达到1.84 g/L。游离细胞催化重复使用批次为2次,固定化细胞重复使用批次为4次,GAMG的产量维持在1.83 g/L,固定化细胞催化周期为36h,相比游离细胞缩短了一半。