不同载体蛋白对18C型肺炎多糖结合疫苗稳定性影响的比较

目的比较以牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)及破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)作为载体蛋白对18C型肺炎多糖结合疫苗稳定性的影响。方法采用点击化学法分别以BSA及TT作为载体蛋白制备18C型肺炎多糖结合疫苗。将2种疫苗在2~8℃条件下保存2、4、8个月,考察疫苗稳定性;分别于(25±2)℃条件下保存2、4、6周及(37±2)℃条件下保存7、14、21 d,考察疫苗的加速稳定性。每个时间点样品均进行外观检查、多糖含量、蛋白含量、pH测定、无菌检查及游离多糖含量测定。结果以TT及BSA作为载体蛋白制备的结合疫苗各项稳定性指标均符合《中国药典》三部(2010版)的相关要求,其中不同温度部分检测时间点结合物Ps-TT的游离多糖含量显著低于Ps-BSA(P<0.05)。结论 TT作为载体蛋白制备18C型肺炎多糖结合疫苗的稳定性明显优于BSA。

3型肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗的研制

目的:研制3型肺炎球菌荚膜多糖-CRM197结合疫苗。方法:将3型肺炎球菌的荚膜多糖与蛋白CRM197通过化学方法偶联结合,制备成多糖蛋白结合疫苗并使用该疫苗免疫幼小鼠。结果:经过实验条件的考察,发现在85℃,0.2mol/L乙酸水解处理多糖1 h,活化度为10.0,投料比为20∶10时制得的疫苗,在小鼠体内产生了高滴度的抗体。结论:该实验条件下制备的结合疫苗保留了完好的抗原性,以本工艺条件制备3型肺炎球菌荚膜多糖蛋白结合疫苗是可行的。

A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗及b型流感嗜血杆菌结合疫苗中丙酮残留量检测方法的建立与验证

目的建立A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗和b型流感嗜血杆菌结合疫苗中丙酮残留量的检测方法并加以验证。方法参照《中华人民共和国药典》三部（2010年版）中＂毛细管柱顶空进样等温法＂,优化色谱条件,建立A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗和b型流感嗜血杆菌结合疫苗中丙酮残留量的检测方法并对该方法进行验证及初步应用。结果色谱条件为顶空平衡温度70℃,顶空平衡时间40 min,汽化室温度200℃,柱箱温度40℃,检测器温度250℃,进样量为1.0 m L,载气（高纯氮气）流量1.3 m L/min,尾吹气（高纯氮气）流量5 m L/min,分流比1∶1。丙酮质量分数在2×10^-6-5×10^-5范围内具有良好的线性关系（r〉0.99）。丙酮的平均回收率及相对标准偏差（RSD）分别为86.05%-105.11%及2.1%-9.5%,检测限为2×10^-6,定量限为3×10^-6。结论本方法的线性、特异性、准确性、重复性等均符合规定,方法准确、稳定,可用于A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗和b型流感嗜血杆菌结合疫苗中丙酮残留量的检测。

肺炎链球菌18C型糖蛋白结合物的制备及其免疫原性

制备肺炎链球菌 18C型荚膜多糖 破伤风类毒素结合物 (CPS TT) ,测定结合物的理化性质、抗原特异性及其在动物中的免疫原性。结果显示 ,结合物能与相应的多糖和破伤风抗血清形成明显的沉淀线 ,蛋白 /多糖比率为 1.86 ,结合物分子大小 (Kd值 )为 0 .0 5 8。注射小鼠后可诱导明显的抗体应答 ,而且随着注射针次的增加 ,抗体反应水平明显增高 ,显示加强效应。结果表明 ,制备的肺炎链球菌糖蛋白结合物抗原性良好 ,具有胸腺依赖性抗原的特性 。

6B型肺炎球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合疫苗的制备及其免疫原性

目的 制备6B型肺炎球菌荚膜多糖(6B-PNCPS)-破伤风类毒素蛋白(TT)结合疫苗,并研究其免疫原性。方法6B-PNCPS用溴化氰活化后与己二酰肼形成多糖-酰肼基衍生物,然后在蛋白活化剂碳二亚胺作用下将6B-PNCPS与TT进行共价结合。分别将其结合物及多糖免疫NIH小鼠,用ELISA检测小鼠血清中抗6B-PNCPS抗体。结果6B-PNCPS-TT结合物经凝胶色谱分析显示具有较6B-PNCPS更大的相对分子质量,多糖/蛋白比为1.42-1.66。结合物具有6B-PNCPS的血清学特异性,所诱生的抗6B-PNCPS特异性IgG抗体滴度与6B-PNCPS差异有显著意义。结论 用该法制备6B-PNCPS-TT结合疫苗,具有良好的免疫原性。

23F型肺炎球菌多糖与CRM197蛋白结合物制备及特性研究

目的采用改良胺化还原法,白喉无毒突变体CRM197蛋白作为载体,制备23F型肺炎球菌多糖蛋白结合物。方法在还原胺法的基础上,以1,6-己二酰肼(ADH)为分子臂,在碳二亚胺(EDAC)作用下衍化CRM197蛋白,衍化后蛋白再与多糖上的醛基反应,形成共轭结合;采用高效液相色谱技术(HPLC)、免疫扩散等方法分析结合物,并将获得的结合物免疫NIH小鼠,用ELISA方法检测多糖IgG水平。结果 HPLC图谱和免疫扩散检测结果证明了结合物的获得;动物免疫产生了较多糖高的抗23F肺炎多糖抗体,并有免疫记忆发生。结论采用改良还原氨化法可以制备出动物免疫原性良好的23F型多糖蛋白结合物。

高效阴离子交换色谱-脉冲安培法检测冻干b型流感嗜血杆菌结合疫苗的游离多糖含量

目的 建立高效阴离子交换色谱-脉冲安培(HPAEC-PAD)法检测冻干b型流感嗜血杆菌(Hib)结合疫苗中游离多糖含量的方法,并对其进行验证,为Hib结合疫苗的质量监控提供依据。方法 优化水解供试品的实验条件,利用HPAEC-PAD法检测供试品中多聚磷酸核糖基核糖醇(PRP)含量。色谱条件采用CarboPacPA10分析柱(2mm×250mm)与CarboPac PA10保护柱(2 mm×50 mm),氢氧化钠-醋酸钠溶液梯度洗脱,流速为0.25ml/min,脉冲安培检测器,进样体积为20μl。用乙醇分步沉淀法、C4固相萃取法和超速离心法分离Hib游离多糖,并对三种方法得到的结果进行比较。同时验证方法的系统适用性、特异性、线性、精密度及准确性。结果 确定水解条件为终浓度0.4mol/L的NaOH,于37℃振荡1.5 h。本公司生产的冻干Hib结合疫苗不可用C4固相萃取柱分离游离多糖,确定了超速离心联合HPAEC-PAD法为冻干Hib结合疫苗游离多糖检测的最适方法。该方法专属性、分离度良好;PRP浓度在0.1962~19.616μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系,R2>0.99。3批供试品分别测定6次,RSD分别为4.1%、2.3%、3.3%,不同时间测得的中间精密度RSD分别为8.3%、3.6%和9.1%。游离多糖的加标回收率分别为102.9%、94.3%、92.0%,RSD分别为3.9%、8.7%、5.3%。结论 初步建立了冻干Hib结合疫苗游离多糖含量测定的超速离心联合HPAEC-PAD法。该方法具有良好的准确性、精密度及稳定性,可用于冻干Hib结合疫苗中游离多糖含量的检测。

C群脑膜炎球菌结合疫苗的质量控制与生产的科学挑战

世界卫生组织 (WHO)生物制品标准化专家委员会于 1976年通过了脑膜炎球菌多糖疫苗的建议 ,并于 1978年和 1981年进行了修订。在临床研究中 ,疫苗的有效率至少达 90 % ,证明其在疫苗接种计划中高度有效。然而 ,不能在幼婴中诱生保护性应答或免疫记忆制约了其在英国婴儿免疫接种计划中的应用。随着 b型流感杆菌 (Hib)结合疫苗的成功引入 ,C群脑膜炎球菌 (Men C)荚膜多糖结合疫苗的研究取得了显著的进展。临床对照试验已证实它们在所有年龄组中均可诱生针对 Men C多糖的保护性水平的抗体 ,并且作为 T细胞依赖性抗原 ,能诱导免疫记忆和抗荚膜抗体的亲和力成熟。英国引入 Men C结合疫苗后 ,证实该疫苗可提供保护性免疫。 WHO已经制定了有关这些新疫苗生产和检定的建议。

以重组肺炎球菌表面黏附素A为载体蛋白的流感嗜血杆菌多糖结合疫苗的实验研究

目的：研究以肺炎球菌表面黏附素（PsaA）为蛋白载体的 b 型流感嗜血杆菌（Hib）多糖结合疫苗的制备及其免疫原性和免疫保护作用。方法用基因工程技术制备 PsaA 基因重组蛋白（rPsaA），通过酰胺缩合法与 Hib 多糖偶联结合，制成结合疫苗（Hib-PsaA）。用此疫苗免疫接种3周龄幼鼠，同时以破伤风类毒素和 B 型流感嗜血杆菌（Hib）多糖结合疫苗（Hib-TT）接种小鼠作为对照及磷酸盐缓冲液（PBS）接种作空白对照。末次免疫后2周观察小鼠对 Hib 多糖和 PsaA 蛋白的免疫原性应答；同时以肺炎球菌分别注入免疫后小鼠和未免疫的对照小鼠听泡，分别于攻击后第3天和第7天观察小鼠中耳内细菌清除率和中耳炎症反应情况，观察新型疫苗的免疫保护作用。结果以基因工程技术成功制备并纯化 rPsaA 蛋白，并运用酰胺缩合法与 Hib 多糖偶联结合，结合物的洗脱峰前移，证明偶联成功。接种该结合疫苗的小鼠产生的抗 PsaA 的抗体 IgG 几何平均滴度（GMT）为4525；抗 Hib 抗体 IgG 的 GMT 为1393。在接种 Hib-TT 疫苗的对照组中，小鼠产生的抗 Hib 抗体 GMT 为1493，两种疫苗的抗 Hib 抗体 GMT 差异无统计学意义，但是 Hib-PsaA 结合疫苗显示出对肺炎球菌的免疫应答，优于以破伤风类毒素为载体的结合疫苗。细菌攻击后第3天实验组小鼠中耳细菌清除率明显高于对照组，组织病理学检查实验组小鼠细菌攻击后第3天和第7天中耳炎症反应明显轻于对照组，显示了 Hib-PsaA 结合疫苗针对肺炎球菌的有效免疫保护作用。结论运用基因工程技术可获得高纯度、高产量的 rPsaA 蛋白，以酰胺缩合法可成功将 rPsaA 蛋白与 Hib 多糖偶联结合，所制备的多糖蛋白结合疫苗在幼小鼠体内可诱导针对 rPsaA 蛋白与 Hib 多糖的免疫应答反应，并且可有效预防肺炎球菌导致的急性中耳炎。提示该疫苗免疫可以在预防 Hib 感染性疾病的同时，对肺炎链球菌导致的急性中耳炎可能有一定的预防作用。

A、C群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗免疫学效果观察

目的:对A、C群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗(ACHib)免疫学原性进行观察。方法:选择300例3至12月龄健康婴幼儿作为研究对象,按照盲态观察法将所选婴幼儿分为3-6、7-12月龄2个年龄段,各有150例,参照组和探究组各75例。探究组仅注射ACHib疫苗,参照组同时注射Hib结合疫苗以及A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗。结果:免疫后易感人群Hib以及A、C脑膜炎球菌血清抗体阳转率均超过90%,探究组与参照组阳转率差异不显著(P>0.05),2组各年龄段以及非易感人群Hib以及A、C脑膜炎球菌血清抗体阳转率差异不具有统计学意义(P>0.05)。结论:A、C群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗免疫原性较好,能够发挥3种病原菌的预防作用。

19F型肺炎球菌荚膜多糖与载体蛋白P64K结合物的制备及免疫原性

目的:采用改良胺化还原法,重组B群脑膜炎球菌外膜蛋白(rP64K)作为载体蛋白,制备19F型肺炎球菌荚膜多糖(PN19F)结合物。方法:在胺化还原法的基础上,以1,6-己二酰肼(ADH)为分子臂,在碳二亚胺(EDAC)作用下衍化rP64K,蛋白衍化后再与多糖上的醛基反应,形成共轭结合。采用HPLC、电泳、免疫印迹等方法分析结合物,并将获得的结合物免疫NIH小鼠,用ELISA方法检测多糖IgG水平。结果:电泳和免疫印迹证明了结合物制备成功。动物免疫产生了高滴度的抗PN19F的抗体,并有免疫记忆发生。结论:新的结合方法和新的载体蛋白能有效提高结合效率,以本工艺制备PN19F蛋白结合疫苗是可行的。

不同链长6A型肺炎球菌荚膜多糖与多糖结合物的稳定性及小鼠免疫原性

目的研究不同链长的6A型肺炎球菌荚膜多糖(type 6A pneumococcal capsular poly-saccharide,Pn6A)稳定性差异及链长对结合物稳定性和免疫原性的影响.方法采用高压均质机获得不同链长的Pn6A,并在1-氰基-4-二甲胺基吡啶四氟硼酸盐作用下与破伤风类毒素-己二酰肼衍生物形成共轭结合物.通过比较原始多糖、多糖降解物及结合物的核磁共振氢谱验证结构的正确性,通过硫酸蒽酮法和速率比浊法定量比较抗原性;通过高效液相-分子尺寸排阻层析-多角度激光散射仪比较不同链长多糖的稳定性;分析结合物物理化学(理化)性质,并通过重均相对分子质量(weight-average relative molecular weight,Mw)变化及游离多糖变化比较结合物稳定性;用原始多糖和结合物分别皮下免疫NIH小鼠3次,ELISA检测抗多糖IgG水平.结果Pn6A经机械剪切3、8、20次后,Mw由14.01×10^(5)g/mol分别下降为1.55×10^(5)、0.92×10^(5)和0.58×10^(5)g/mol,其对应结合物理化数据相近;核磁共振结果表明,多糖降解物和结合物各特征质子的化学位移相比原始多糖未发生改变;硫酸蒽酮法和速率比浊法定量计算得到的不同多糖和结合物单位抗原值相近;在不同pH及温度条件下,长链多糖及其结合物的Mw和游离多糖变化均大于短链多糖.不同链长多糖结合物免疫小鼠后诱导的IgG抗体滴度均高于原始多糖(F=2.90,P=0.048),而不同结合物之间的免疫原性差异无统计学意义(F=1.39,P=0.267).结论机械剪切不会破坏Pn6A化学结构和抗原性;Pn6A链长越短,所获得的多糖及结合物越稳定;Pn6 A经机械剪切后制备的结合物在小鼠体内可诱导良好的免疫应答.

C反应蛋白对评价肺炎结合疫苗预防肺炎效果的作用

尽管肺炎球菌蛋白-多糖结合疫苗（PCV）可使胸部X线摄片证实的肺泡实变（CXR—AC）降低20%～37%，但在未感染HIV的儿童中，PCV对预防临床确诊的下呼吸道感染（C-LRTI）的效力仅为6%～9%。此项研究旨在明确C反应蛋白（CRP）和／或降钙素原水平能否用于检测9价PCV的疫苗效力（VE）及疫苗对肺炎负荷的影响，并与CXR—AC指标进行比较。

4型肺炎球菌多糖丙酮酸含量核磁共振测定方法的建立及验证

目的 建立检测4型肺炎球菌多糖侧链上的丙酮酸(pyruvic acid, PA)含量的定量核磁共振(quantitativenuclear magnetic resonance, qNMR)方法,并进行验证。方法 用以3-(三甲基硅)丙酸-D4钠盐为内标的重水作为溶剂,在600 MHz核磁共振仪上采集波谱,采集参数为:脉冲程序zg30,弛豫延迟时间9 s,扫描次数512次。对方法进行线性、范围、专属性、准确度、精密度、耐用性验证。结果 PA含量在0.10~12.00 mg/mL范围内线性良好,且R~2> 0.99。以PA上的甲基质子峰(化学位移1.54 ppm)为特征峰测定PA信号峰,qNMR检测方法专属性良好。两种方法的回收率分别在93.52%~101.37%和92.71%~100.10%之间;建立的方法重复性及中间精密度良好,不同PA含量测定值RSD分别为3.67%,2.12%和3.70%;改变温度和扫描次数,2种条件的测定结果差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 建立的4型肺炎球菌多糖中PA含量qNMR检测方法简便、切实有效,为13价肺炎球菌结合疫苗的生产提供了一种可靠的产品放行或过程监测方法。

基于连续流动注射安培法定量检测多糖蛋白结合疫苗中氰化物的残留量

目的 建立基于连续流动注射安培法的多糖蛋白结合疫苗中氰化物残留量的检测方法,并进行验证。方法 超滤法去除样品中的大分子物质后,采用3700全自动化学分析仪检测氰化物残留量,进样时间为:35 s;进样体积为:200μL;泵速为:40%;样品周期时间为:140 s;紫外波长为:312 nm;安培检测器。验证方法的专属性、基质效应、线性范围、检出限、定量限、准确性、精密性及稳定性。采用建立的方法检测5个厂家生产的b型流感嗜血杆菌结合疫苗及A群C群脑膜炎球菌结合疫苗多糖衍生物原液(13批)、结合物原液(21批)中氰化物残留量。结果 空白样品对检测无干扰;b型流感嗜血杆菌结合疫苗多糖衍生物和结合物原液、A群C群脑膜炎球菌结合疫苗多糖衍生物和结合物原液基质效应溶液的回收率分别为97.4%、102.4%、96.8%、99.8%,CV均<15%;氰基浓度在0.312 5~80 ng/mL范围内,与峰高呈良好的线性关系,回归方程为:y=133.13 x+57.556,R^(2)=0.999 1;检出限为0.2 ng/mL,定量限为0.6 ng/mL;加入氰基浓度为5、10、20 ng/mL对照溶液样品的回收率均值分别为108.9%、106.5%、103.5%,RSD为6.4%;精密性验证的CV均<15%;氰基浓度为80、40、20、5 ng/mL的对照溶液连续进样20针的平均浓度分别为76、38、18、5 ng/mL,CV均<15%。13批多糖衍生物原液样品均有检出氰化物残留,21批结合物原液样品中2批未检出,其他均有检出。结论 本研究建立的方法具有良好的准确性、精密性及稳定性,可应用于多糖蛋白结合疫苗中氰化物残留量的定量检测。

新型百日咳疫苗的研发

细菌蛋白一多糖结合物疫苗能有效诱导保护性抗体，并维持较长时间，这种蛋白一多糖结合疫苗的特性已经在肺炎球菌疫苗、b型流感嗜血杆菌（Hib）疫苗以及脑膜炎球菌疫苗的长期使用中已得到验证。

如何看待二类疫苗的接种

二类疫苗是指由公民自费并且自愿受种的疫苗。目前我国儿童常用的二类疫苗主要有流感疫苗、水痘减毒活疫苗、b型流感嗜血杆菌疫苗、其他类肺炎疫苗(23价肺炎球菌多糖疫苗、13价肺炎球菌多糖结合疫苗)、流脑A+C群结合疫苗、流脑A+C+Y+W135群多糖疫苗、五价轮状病毒减毒活疫苗、脊髓灰质炎-百白破-Hib(五联)联合疫苗及肠道病毒71型灭活疫苗(手足口病疫苗)等。

第二类疫苗断供时,如何补救?

2015年上半年，当时国内唯一适用于2岁以下婴幼儿的7价肺炎球菌多糖结合疫苗在中国全面退市。直至2017年3月，断档了近两年的肺炎球菌多糖结合疫苗回归，其疫苗也由7价升级为13价肺炎球菌多糖结合疫苗，并在全国各地陆续开始接种。2017年可以预防百日咳、白喉、破伤风、脊髓灰质炎和b型流感嗜血杆菌的5种疾病的疫苗，即五联疫苗，又出现全国多个省市供货告急情况。