胶州湾浮游桡足类18S核糖体RNA基因(18S rDNA)扩增及序列变异初步研究

采用PCR扩增、文库构建、限制性片段长度多态性分析、序列分析和系统学分析等方法,初步研究了夏季胶州湾上层海水浮游桡足类核糖体小亚基RNA基因(18SrDNA)约1.5kb片段的序列变异。从浮游生物混合DNA中选择性扩增桡足类18SrDNA,建立桡足类18SrDNA变异类型文库,并从文库中随机挑选的30个克隆进行分析。结果表明,VspI限制性内切酶能将这些克隆分成频率分别为0.17、0.23和0.6的3种操作分类单元(OTUs),遗传多样性指数达到0.95。3条OTU代表克隆序列与甲壳纲桡足亚纲核苷酸差异数在75.4—97.8之间,而与其他亚纲的差异都高于100。3条OTU代表克隆序列均属于桡足亚纲,其中,AY437861和AY437862属于哲水蚤目。3条OTU代表克隆序列可分为2个高变异区和3个相对保守区,其GC%分别为47.37%、48.16%和48.57%。研究结果表明,混合DNA提取方法简单,设计的引物可选择性地扩增浮游桡足类18SrDNA,根据18SrDNA序列序列变异描述浮游桡足类多样性是可行的。研究结果也为在浮游桡足类分类中引入18SrDNA序列奠定了基础。

胶州湾浮游桡足类18S核糖体RNA基因序列变异分析

设计了桡足类特异引物,从胶州湾浮游生物混合DNA中选择性扩增了浮游桡足类18S核糖体RNA基因片段,建立了该基因片段变异类型文库。从文库中随机选择83个克隆,对所含的18S核糖体RNA基因片段进行了V .spI和BshNIRFLP分析,发现5种操作分类单元(OTU) ,并对这些OTU的代表克隆进行了测序。分析发现获得的克隆均属于桡足亚纲。根据各OTU覆盖的克隆数计算的胶州湾浮游桡足类遗传多样性指数为0 .96。特定基因序列分析能提供易整合、易比较的多样性数据,也是建立浮游生物群落结构分子生物学剖分方法的基础和形态分类的补充。

新疆柔叶真藓居群18S核糖体RNA基因序列分析

柔叶真藓(Bryum cellulare Hook.)是真藓属植物。目前对分布在新疆阿尔金山国家级自然保护区不同地理居群的柔叶真藓遗传多样性研究还未见报道。本研究以采自于该保护区四个不同地理居群的柔叶真藓为样品对其18S核糖体RNA基因(18S r DNA)序列进行分析。结果表明:样本测序拼接完成后的序列长度在1 712~1 761 bp之间,进行空位剪切及比对后长度为1 698 bp。整个序列中有三个碱基位置上的差异,其中变异位点有12个,A、T、C、G的平均含量比率分别为24%、27%、23%、26%。再通过从NCBI的Gen Bank进行同源性搜索得到的相似性序列均属于真藓属,增大了序列的可靠性。将与其序列结合检测遗传距离及构建系统进化树,进行同源性分析可知,这种差异由于18S核糖体RNA基因序列本身的特性,表明种群的遗传距离与地理环境和位置有一定的相关性,其中在环境的变化及变异的可能性对四个不同地理居群的柔叶真藓植物有影响。

家蝇核糖体蛋白S18基因的克隆及表达模式研究

旨为证实核糖体蛋白S18(Ribosomal protein S18,RPS18)基因在家蝇体内的表达稳定性。从构建家蝇幼虫c DNA文库中筛选到核糖体蛋白S18基因,以c DNA为模板,通过PCR扩增,获得RPS18基因完整编码序列(登录号:KT006855),运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行预测和分析。构建p ET28a/RPS18重组质粒,转化到大肠杆菌Transetta(DE3)中进行诱导表达及蛋白纯化,制备多克隆抗体并进行抗血清特异性分析。应用RT-PCR、q PCR及Western-blot从转录、翻译水平上分析RPS18基因在家蝇不同发育时期和三龄幼虫不同组织中的表达情况。结果表明,RPS18基因ORF全长459 bp,编码152个氨基酸,理论分子量为17 590.5 Da,等电点为10.48;将构建的重组质粒转入大肠杆菌Transetta(DE3)中,纯化得到RPS18蛋白;将该纯化蛋白免疫大白兔获得多克隆抗体,His单抗鉴定及抗血清特异性分析显示,其均可见单一条带;RT-PCR、q PCR及Westernblot分析表明,RPS18基因在家蝇不同发育时期及幼虫不同组织均能够稳定表达;综合分析表明,该基因在家蝇不同发育时期及幼虫不同组织均保持较好的表达稳定性。

血吸虫种株间18S小亚基单位核糖体核酸基因的同源性及其PCR法检测单个尾蚴的敏感性

目的探索日本血吸虫中国大陆株、菲律宾株及曼氏血吸虫18S小亚基单位核糖体核酸基因(18S-rRNA)序列的同源性及采用该基因建立PCR法检测水体中低密度血吸虫尾蚴的可能性。方法提取日本血吸虫中国大陆株、菲律宾株及曼氏血吸虫基因组DNA,采用PCR方法检测上述基因组中同一目的DNA片段,比较其同源性;分别以经沸水加热处理、氨水处理及NaOH、HCl、乙醇沉淀处理和未经处理的单个尾蚴标本为模板,采用PCR法扩增,比较对单个尾蚴的检出率。结果以日本血吸虫中国大陆株、菲律宾株和曼氏血吸虫基因组DNA为模板,均能扩增出长度为469bp的DNA片段。经氨水处理和NaOH、HCl、乙醇沉淀法处理的单个尾蚴标本,PCR方法均能扩增到目的基因。在未经处理或沸水加热处理的单个尾蚴标本中,仅有50%标本能扩增到目的基因。结论血吸虫不同种株间18S-rRNA基因具有广泛同源性。经氨水处理或NaOH、HCl、乙醇沉淀法处理的标本,采用PCR法对低密度尾蚴的检出率高于未经处理或经沸水加热处理的标本。

多头带绦虫湖南分离株核糖体18S基因系统进化分析

为阐明多头带绦虫湖南分离株核糖体小亚基(18S rRNA)基因序列的遗传变异情况,并用18S序列构建多头带绦虫与其他带科绦虫的种群遗传关系。利用PCR技术扩增多头带绦虫的18S基因,应用Clustal X1.81程序对序列进行比对,再利用Mega4.0程序进行NJ法绘制种系发育树。结果显示:所获得的18S基因序列长度一致,均为1 080 bp,基因序列存在一定的遗传差异。种系发育分析结果显示,所有的多头带绦虫分离株与已知多头带绦虫位于同一分支。多头带绦虫18S基因序列种内相对保守,种间差异较大,可以作为种间遗传变异研究的标记,从而为多头带绦虫的群体遗传研究奠定基础。

胖尾刺虫(纤毛门,旋毛纲,下毛目)16s小亚基单位核糖体RNA基因的序列测定及其系统地位初探

对分离自青岛沿岸的下毛目纤毛虫 胖尾刺虫 (Uronychiatransfuga)的 16s小亚基单位核糖体RNA(16s likeSmallSubunitrRNA)基因进行了序列测定 ,通过与目内其它相近属多种纤毛虫的比较分析 ,认为游仆虫属 (Euplotes)首先从下毛目中分离出来 ,其次是属刺虫属和双眉虫属 (Diophrys) ,其间邻近的遗传距离共同构成了下毛目内最为进化的类群 游仆亚目 (Euplotina)。同时 ,序列分析也支持该目其它三个亚目的划分 :散毛亚目 (Sporadortrichina) ,排毛亚目 (Stichotrichina)和尾柱亚目 (Urostylina)。这与形态学资料是吻合的。

海链藻目核糖体RNA基因片段的扩增及多样性分析

海链藻目(Thalassiosirales)的海链藻属(Thalassiosira)和骨条藻属(Skeletonema)微藻是形成春季赤潮的主要种类。为利用分子生物学方法分析表层海水主要赤潮形成藻的动态变化、快速鉴定赤潮形成藻种,设计了海链藻目特异引物,扩增了胶州湾近岸表层海水海链藻目18S核糖体RNA基因片断。随机测定10个序列,其中4个与海链藻属的Thalassiosi-ra concaviuscula的完全相同,其余的可确定属于海链藻属。表明该引物对能选择性地扩增海链藻目18S核糖体RNA基因片断。

16S核糖体RNA基因和RNA聚合酶β亚基基因及基质辅助激光解析／电离飞行时间质谱鉴定海洋副溶血性弧菌及其同源性分析的研究

目的评价16S核糖体RNA基因（16SrRNA）、RNA聚合酶β亚基基因（rpoB）及基质辅助激光解析／电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）技术对海洋副溶血性弧菌的鉴定及同源性分析的性能。方法将50株海洋副溶血性弧菌以及与其亲缘关系相近的30株海洋溶藻弧菌、8株海洋坎贝式弧菌、11株海洋哈维氏弧菌、3株海洋需钠弧菌、2株海洋创伤弧菌分别用16SrRNA、rpoB和MALDI-TOFMS技术3种方法进行鉴定并做系统进化树、聚类分析，比较分析结果。结果50株海洋副溶血性弧菌用16SrRNA鉴定出5株，rpoB鉴定出41株，MALDI-TOFMS技术鉴定出41株。16SrRNA系统进化树的结果不能将海洋副溶血性弧菌和海洋溶藻弧菌、海洋坎贝式弧菌、海洋需钠弧菌、海洋创伤弧菌分开。rpoB和MALDI．TOFMS可以准确地做出同源性分析。rpoB鉴别来自不同地域的海洋副溶血性弧菌的能力优于MALDI-TOFMS。而MALDI-TOFMS在海洋副溶血性弧菌的环境株和临床株的鉴别上优于rpoB。结论rpoB和MALDI．TOFMS技术鉴定海洋副溶血性弧菌准确，二者相结合是进行海洋副溶血性弧菌鉴定和同源性分析的适宜技术。

脑脊液细菌16S核糖体RNA基因检测在抗生素治疗后化脓性脑膜炎患儿中的应用价值

目的探讨脑脊液细菌16S核糖体RNA(16S rRNA)基因检测在抗生素治疗后化脓性脑膜炎患儿中的应用价值。方法选择化脓性脑膜炎患儿60例,在抗生素使用早期及后期采集脑脊液标本,同时进行16S rRNA基因检测及细菌培养,比较两种方法的检测阳性率,分析抗生素应用时间对两种检测方法结果的影响。结果脑脊液16S rRNA基因检测阳性21例(35.0%),脑脊液细菌培养阳性9例(15.0%),16S rRNA基因检测阳性率高于细菌培养(P<0.05)。抗生素应用早期16S rRNA基因检测阳性率略高于抗生素应用后期,但差异无统计学意义(P>0.05);抗生素应用早期脑脊液细菌培养检测阳性率高于抗生素应用后期(P<0.05)。结论对于抗生素治疗后化脓性脑膜炎患儿,脑脊液16S rRNA基因检出阳性率高于脑脊液细菌培养,且可能更少受抗生素应用时间的影响。

23S核糖体RNA结构域Ⅴ区位点A2063G、A2064G突变与儿童难治性肺炎支原体肺炎的相关性

目的 探讨23S核糖体RNA(rRNA)结构域Ⅴ区位点A2063G、A2064G突变与儿童难治性肺炎支原体肺炎的相关性。方法 将184例肺炎支原体肺炎患儿分为难治性肺炎组56例和非难治性肺炎组128例。比较两组患儿白细胞和中性粒细胞计数,降钙素原、C反应蛋白(CRP)、血沉、ALT、AST、乳酸脱氢酶(LDH)水平,以及23S rRNA结构域Ⅴ区位点A2063G、A2064G突变情况。分析相关指标与难治性肺炎支原体肺炎的相关性,并采用多因素Logistic回归模型分析难治性肺炎支原体肺炎的危险因素。结果 难治性肺炎组的CRP、血沉、LDH水平,中性粒细胞计数,以及A2063G和/或A2064G位点突变的比例均高于非难治性肺炎组(均P<0.05)。CRP、血沉、LDH水平,中性粒细胞计数,以及A2063G和/或A2064G位点突变情况均与难治性肺炎支原体肺炎具有相关性(均P<0.05)。Logistic回归模型分析结果显示,CRP、血沉、LDH水平升高,以及A2063G或/和A2064G位点突变均是难治性肺炎支原体肺炎的危险因素(均P<0.05)。结论 存在23S rRNA结构域Ⅴ区位点A2063G、A2064G突变的肺炎支原体肺炎患儿发展为难治性肺炎支原体肺炎的可能性增大,检测23S rRNA结构域Ⅴ区位点A2063G、A2064G的突变情况对判断肺炎支原体肺炎患儿病情和制定治疗方案具有重要意义。

单条固定线虫基因组DNA提取及18S rRNA基因PCR扩增

根据线虫18S核糖体RNA基因PCR扩增效果比较了丙酮、乙醇、乙醇+0.05mol/LEDTA(pH8.0)和5%海水福尔马林4种固定剂,碱裂解和蛋白酶K处理2种单条线虫基因组DNA提取方法的优劣。用乙醇固定的样品最适合制备PCR模板DNA,而5%海水福尔马林固定的样品能最完整地保持样品形态。蛋白酶K处理获得的DNA较碱裂解获得的更适合PCR扩增。结果有助于分子生物学方法在海洋线虫分类、多样性和生态学研究中的应用。

18S rRNA基因siRNA表达质粒的构建和鉴定

目的:构建和鉴定水牛18SrRNA干扰真核表达载体,为进一步研究18SrRNA功能奠定基础。方法:人工设计合成水牛18SrRNA-sh565干扰序列,经基因重组定向克隆插入到真核表达载体pGPH1/GFP/Neo,随机挑选2个克隆菌提取质粒并进行酶切和测序鉴定。结果:质粒酶切和测序结果显示,siRNA寡核苷酸按正确方向和序列插入质粒。结论:成功构建pGPH1/GFP/Neo-buffalo-18S rRNA-sh565干扰表达质粒。

大鼠心肌组织中microRNA和18S rRNA的降解与死亡时间的相关性

目的探讨大鼠死后心肌组织中microRNA和18S rRNA的含量变化与死亡时间的关系。方法将SD大鼠断颈处死后置于25℃室温、50%湿度的环境中,于死后不同时间提取心肌组织中总RNA。利用实时荧光定量PCR检测大鼠心肌组织中miR-1-2和18S rRNA的含量变化,结果用循环阈值(Ct值)表示,分析死亡时间与Ct值的关系,最终建立死亡时间推断的回归分析方程。结果大鼠死后120h内心肌组织中miR-1-2含量无明显变化,此后开始下降;而18S rRNA含量在96 h内逐渐增多,随后开始缓慢下降。大鼠死后不同时间18S rRNA的Ct值以及18S rRNA和miR-1-2的ΔCt值与PMI呈非线性相关,二次曲线拟合的R2值分别为0.9487、0.8072。结论 18S rRNA的Ct值和18S rRNA与miR-1-2的ΔCt值与PMI之间存在明显非线性关系,可以作为早期死亡时间推断的指标。

细菌16S rRNA基因芯片的构建及其在细菌鉴定中的应用

目的:构建细菌16SrRNA基因芯片,并将其应用于细菌检测。方法:根据细菌16S rRNA基因保守区设计合成针对革兰阳性细菌、革兰阴性细菌的通用探针,以及针对肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的特异性探针,并构建基因芯片。利用所构建的芯片检测相应细菌,并观察其特异性及敏感性。结果:成功构建了相应的基因芯片;所构建的基因芯片能准确检出相应细菌,无交叉阳性现象,检测时间约需6 h;所构建的基因芯片能检测出DNA含量为15 fg的大肠埃希菌基因组DNA。结论:细菌16S rRNA基因芯片可用于细菌的检测,具有良好的特异性及敏感性,且耗时少。

运用Cytb和12s rRNA基因鉴别梅花鹿(Cervus nippon)和马鹿(Cervus elaphus)的研究(英文)

本研究介绍了运用细胞色素b基因和12s核糖体RNA基因部分序列的系统学和核甘酸距离分析来鉴别降解的梅花鹿和马鹿样品。采用PCR和直接测序技术获得了8份嫌疑样品402bp细胞色素b基因序列,并与来自GenBank数据库27份同源的细胞色素b基因序列进行比对。3份嫌疑样品与梅花鹿的核甘酸距离值相同(0.026±0.006),小于梅花鹿与东部马鹿间最小的核甘酸距离值(0.036)。并且梅花鹿和马鹿的系统学分析表明这些样品与梅花鹿聚为一枝,因此可以推测它们来源于梅花鹿。同样的方法得出另3份嫌疑样品来源于马鹿。该结果被387bp12s核糖体RNA基因序列的系统学和核甘酸距离分析进一步证实。该方法是有效的,花费的时间少,能帮助减少同类野生动物案件的发生。图2表1参13。

小鲵科线粒体16S rRNA基因序列分析及其系统发育

To study the phylogeny of Hynobiidae, we amplified DNA fragments of 470 bp 16S ribosomal RNA (16S rRNA) gene on mitochondrial DNA from Ranodon sibiricus and Ranodon tsinpaensis. PCR products were cloned into PMD18 T vector after purification. These sequences were determined and deposited in the GenBank (accession numbers: AY373459 for Ranodon sibiricus, AY372534 for Ranodon tsinpaensis). By comparing the nucleotide differences of 16S ribosomal RNA sequences among Liua shihi,Pseudohynobius flavomaculatus and Batrachuperus genus from GenBank database,we analyzed the divergences and base substitution among these sequences with the MEGA software. The molecular results support that B tibetanus, B pinchonii and B karlschmidti are classified into three valid species. Liua shihi has closer phylogenetic relationships to Ranodon tsinpaensis than to other species. More our results reveal that Pseudohynobius flavomaculatus is not a synonym of Ranodon tsinpaensis. .

土壤细菌16SrRNA基因变异型及其与植被的相关研究

绕过细菌的分离培养 ,直接提取土壤DNA ,扩增、克隆土壤细菌群体的 16S核糖体RNA基因 (16SrD NA) .根据该基因各种变异类型的限制性片段长度多型性 ,分析土壤细菌分子遗传多样性及其与植被的相互关系 .植被的改变影响土壤养分 ,进而改变土壤细菌群落结构 .土壤细菌遗传多样性和分化能反映植被的变化 .

拟南芥18srRNA参与隐花色素介导的信号传导途径的研究

通过筛选以拟南芥蓝光受体隐花色素双突变体cry1cry2为遗传背景的激活标签突变体库,得到一株SCC98-D株系,该突变体具有早开花,下胚轴变短,并具有花瓣数目增加等表型,彻底恢复了cry1cry2的晚开花和长下胚轴表型.通过Tail-PCR的方法克隆得到SCC98-D突变体中激活标签插入位点的侧翼序列,通过对该侧翼序列测序发现插入位点在18srRNA的1751bp处,运用RT-PCR方法分析插入位点周围基因的表达,发现只有18srRNA的表达被激活,由此证实了18srRNA参与隐花色素介导的信号传导途径.

16S rRNA基因在临床上的应用进展

传统的细菌检测主要依靠血清学、生物化学、细菌形态学及细菌培养等方法进行分类鉴定,但前三者敏感性和特异性不高,后者费时且阳性率低。近10余年来分子生物学技术发展迅速,各种基因方法如DNA杂交、质粒图谱和16SrRNA序列分析等在临床上得到广泛应用。该文就近年来国外16SrRNA在细菌学研究及其应用的一些新进展作一综述。