基于PERK/ATF4/CHOP信号通路研究滋阴明目方含药血清对衣霉素诱导的ARPE-19细胞的作用机制

目的研究滋阴明目方含药血清对衣霉素诱导ARPE-19细胞的影响及其可能机制。方法构建细胞内质网应激损伤模型,将ARPE-19细胞分为空白组、模型组、空白血清组、滋阴明目方含药血清组、牛磺熊去氧胆酸组。对细胞进行形态观察,CCK-8检测细胞存活率,TUNEL法检测细胞凋亡,Western blot检测细胞蛋白激酶样内质网激酶(PERK)、活化转录因子4(ATF4)、C/EBP同源蛋白(CHOP)蛋白的表达。结果选用浓度50μmol/L衣霉素干预ARPE-19细胞造模。观察细胞形态发现,滋阴明目方含药血清组和牛磺熊去氧胆酸组ARPE-19细胞较模型组细胞数量增多,生长较均匀,漂浮的死亡ARPE-19细胞及碎片减少。与空白组相比,模型组和空白血清组的细胞存活率下降(P<0.01),凋亡率明显上升(P<0.01),PERK、ATF4、CHOP蛋白表达上调(P<0.01)。与模型组相比,滋阴明目方含药血清组细胞存活率上升(P<0.01),凋亡率明显下降(P<0.01),PERK、ATF4、CHOP蛋白表达下调(P<0.01)。结论滋阴明目方含药血清可以减少ARPE-19细胞内质网应激损伤模型的凋亡,其分子机制与调控PERK-ATF4-CHOP信号通路有关。

GLS1通过激活Nrf2/HO-1轴抑制过氧化氢诱导的ARPE-19细胞氧化应激、自噬与凋亡

目的探究GLS1对过氧化氢诱导的ARPE-19细胞氧化应激、自噬与凋亡的影响及机制。方法ARPE-19细胞分为对照组、H_(2)O_(2)组、H_(2)O_(2)+Vector组、H_(2)O_(2)+GLS1组,对照组细胞不做任何处理,H_(2)O_(2)组细胞用200μmol/L H_(2)O_(2)诱导48h,H_(2)O_(2)+Vector组和H_(2)O_(2)+GLS1组细胞转染Vector和GLS1质粒后用200μmol/L H_(2)O_(2)诱导48 h,比色法测定各组细胞SOD、GSH和MDA浓度,透射电镜观察各组细胞自噬小体,流式细胞术检测各组细胞凋亡水平,Western blot检测各组细胞Nrf2、HO-1、LC3-Ⅱ、p62的表达。结果与对照组比较,H_(2)O_(2)组ARPE-19细胞SOD、GSH表达显著下降,MDA显著增加,自噬小体数目显著增加,细胞凋亡显著增加,LC3-Ⅱ表达显著上调,P62、抗核因子红系2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)、血红素氧合酶1(heme Oxygenase-1,HO-1)表达显著下调。与H_(2)O_(2)+Vector组比较,H_(2)O_(2)+GLS1组细胞SOD、GSH表达显著增加,MDA显著降低,自噬小体数目显著减少,细胞凋亡显著减少,LC3-Ⅱ表达显著下调,P62、Nrf2、HO-1表达显著上调。结论GLS1可抑制H_(2)O_(2)诱导的ARPE-19细胞氧化应激、自噬与凋亡,其机制为激活Nrf2/HO-1信号通路。

448 nm蓝光照射致ARPE-19细胞坏死性凋亡研究

长期超风险限值蓝光照射可能导致视网膜变性疾病,而视网膜色素上皮损伤是视网膜光损伤的关键来源。本研究探讨了448 nm蓝光对人视网膜色素上皮细胞的损伤作用及凋亡方式。25 mW/cm2蓝光照射ARPE-19细胞3、6、9、12 h,照后即刻采用钙黄绿素乙酰甲酯染色检测细胞活性,并在照后24 h采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测坏死性凋亡相关基因表达,同时采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测坏死性凋亡和DNA损伤标志蛋白表达。9 h和12 h照射组细胞形态发生显著变化,表现为细胞肿胀、间隙增大、漂浮细胞增多、细胞碎片增加;蓝光照射3~9 h后RIPK1、RIPK3 mRNA表达量较正常组出现明显升高,且在照射9 h时达到最大值;蓝光照射6~12 h后RIPK1、RIPK3、P-MLKL坏死性凋亡蛋白标志物的表达量随蓝光照射时间增加而明显升高,并在照射12 h时达到最高值;蓝光照射3~12 h后DNA损伤标志物γ-H2AX蛋白表达量明显升高,并在照射12 h时达到最高值。蓝光照射9 h坏死性凋亡相关基因表达量达到最大,照射12 h基因表达明显下降但坏死性凋亡相关蛋白表达量累积到最大,这提示25 mW/cm2蓝光照射9~12 h可诱导ARPE-19细胞发生坏死性凋亡,并表明DNA损伤程度与细胞坏死性凋亡发生可能存在关联。

PAX3基因沉默对P19细胞向心肌样细胞分化的影响及其机制

目的:探讨配对盒转录因子3(PAX3)基因沉默对P19细胞向心肌样细胞分化的影响,并阐明其可能作用机制。方法:采用二甲基亚砜(DMSO)诱导P19细胞向心肌样细胞分化,观察诱导分化过程中细胞形态表现,并收集诱导分化第0天(0d组)和第10天(10 d组)的细胞。采用shPAX3慢病毒感染P19细胞,将细胞分为对照组、sh-NC组(阴性对照)和sh-PAX3组(PAX3干扰),实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测PAX3基因沉默的P19细胞构建情况。采用Notch信号激动剂Jagged1处理慢病毒感染后的P19细胞,并采用DMSO诱导分化10 d,将细胞分为DMSO组、DMSO+sh-NC组、DMSO+sh-PAX3组、DMSO+Jagged1组和DMSO+sh-PAX3+Jagged1组。RT-qPCR法检测各组细胞中GATA结合蛋白4(GATA4)、心房利钠尿多肽(ANP)、心肌肌钙蛋白(cTn)T、PAX3、Notch1、Notch胞内结构域(NICD)及Hes家族bHLH转录因子1(Hes1)mRNA表达水平。Western blotting法检测各组细胞中PAX3、Notch1、NICD和Hes1蛋白表达水平。免疫荧光染色法检测各组细胞中cTnI阳性表达情况和心肌样细胞分化率。结果:诱导分化第10天,可观察到自发性节律收缩的心肌样细胞簇。RT-qPCR和Western blotting法检测,慢病毒感染后,与对照组和sh-NC组比较,sh-PAX3组P19细胞中PAX3 mRNA和蛋白表达水平均降低(P<0.05),表明PAX3基因沉默的P19细胞构建成功。RT-qPCR法检测,与0d组比较,10 d组细胞中GATA4、ANP和cTnT mRNA表达水平均升高(P<0.05),PAX3、Notch1、NICD和Hes1 mRNA表达水平均升高(P<0.05);与DMSO组和DMSO+sh-NC组比较,DMSO+sh-PAX3组细胞中GATA4、ANP和cTnT mRNA表达水平均降低(P<0.05),DMSO+Jagged1组细胞中GATA4、ANP和cTnT mRNA表达水平均升高(P<0.05);与DMSO+sh-PAX3组比较,DMSO+shPAX3+Jagged1组细胞中GATA4、ANP和cTnT mRNA表达水平均升高(P<0.05)。Western blotting法检测,与0d组比较,10 d组细胞中PAX3、Notch1、NICD和Hes1蛋白表达水平均升高(P<0.05);与DMSO组和DMSO+sh-NC组比较,DMSO+sh-PAX3组细胞中Notch1、NICD和Hes1蛋白表达水平均降低(P<0.05),DMSO+Jagged1组细胞中Notch1、NICD和Hes1蛋白表达水平均升高(P<0.05);与DMSO+sh-PAX3组比较,DMSO+sh-PAX3+Jagged1组细胞中Notch1、NICD和Hes1蛋白表达水平均升高(P<0.05)。免疫荧光法检测,慢病毒感染后,各组细胞中均有cTnI蛋白阳性表达,与DMSO组和DMSO+sh-NC组比较,DMSO+sh-PAX3组细胞中cTnI蛋白阳性表达减少,心肌样细胞分化率降低(P<0.05);与DMSO组和DMSO+sh-NC组比较,DMSO+Jagged1组细胞中cTnI蛋白阳性表达增加,心肌样细胞分化率升高(P<0.05);与DMSO+sh-PAX3组比较,DMSO+sh-PAX3+Jagged1组细胞中cTnI蛋白阳性表达增加,心肌样细胞分化率升高(P<0.05)。结论:PAX3基因沉默可抑制P19细胞向心肌样细胞分化,其机制可能是通过降低PAX3基因表达抑制Notch信号通路活化实现的。

α-硫辛酸对蓝光诱导损伤的ARPE-19细胞的保护作用

目的 研究α-硫辛酸(ALA)对蓝光诱导损伤的ARPE-19细胞的保护作用。方法 体外培养ARPE-19细胞,随机分为正常组(N组)、药物组(D组)、光照组(L组)、药物+光照组(D+L组)。倒置显微镜下观察ARPE-19细胞形态结构。CCK-8法检测各组ARPE-19细胞活性;流式细胞仪(Annexin V/PI双染色法)检测ARPE-19细胞凋亡率;倒置荧光显微镜检测ARPE-19细胞ROS水平;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测ARPE-19细胞核因子E2相关因子2(Nrf2)、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)、NAD(P)H醌氧化还原酶1(NQO1)、血红素氧合酶-1(HO-1) mRNA表达水平;Western blot检测ARPE-19细胞天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、Nrf2、NQO1蛋白表达水平。结果 N组及D组细胞均呈贴壁生长,分布均匀,形态清晰,细胞存活率差异无统计学意义(P>0.05)。与N组相比,L组细胞皱缩、变小、变圆,失去正常形态,部分细胞不能贴壁生长,细胞存活率降低,细胞凋亡率升高,ROS水平升高(均为P<0.05);与L组相比,D+L组细胞形态改善,大部分细胞呈梭形贴壁生长,细胞轮廓较清晰,小部分细胞失去正常形态结构,细胞存活率升高,细胞凋亡率降低,ROS水平降低(均为P<0.05)。RT-qPCR检测结果显示:与N组相比,L组细胞NQO-1、HO-1的mRNA相对表达量均升高(均为P<0.05),Nrf2、GST的mRNA相对表达量均升高,但差异均无统计学意义(均为P>0.05);与L组相比,D+L组细胞Nrf2、GST、NQO-1、HO-1的mRNA相对表达量均升高(均为P<0.05)。Western blot检测结果显示:与N组相比,L组细胞的Caspase-3、Nrf2蛋白相对表达量均升高(均为P<0.05);与L组相比,D+L组细胞的Caspase-3蛋白相对表达量降低(P<0.05),Nrf2、NQO-1蛋白相对表达量均升高(均为P<0.05)。结论 蓝光会导致ARPEA-19细胞产生氧化应激损伤并最终导致细胞凋亡,而ALA能够增强ARPE-19细胞对蓝光损伤的抗氧化保护作用。

miR-149-3p在先天性心脏病胎鼠心脏组织中的表达及其对P19细胞分化的影响

目的 探讨miR-149-3p在先天性心脏病(CHD)胎鼠心脏组织中的表达及其对小鼠畸胎瘤P19细胞分化的影响。方法 建立CHD室间隔缺损胎鼠模型,于妊娠第19天,HE染色观察心脏组织病理学变化,实时荧光定量PCR(qPCR)检测心脏组织中miR-149-3p和热休克蛋白蛋白家族B成员6(HSPB6)mRNA表达水平。二甲基亚砜(DMSO)诱导P19细胞向心肌细胞分化,并收集分化第0、5、10天的细胞,qPCR检测诱导分化过程中心肌分化标志物GATA结合蛋白4(GATA4)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)、心房利钠尿多肽(ANP)的mRNA表达水平以及HSPB6 mRNA和miR-149-3p表达水平。miR-149-3p过表达慢病毒和空载慢病毒感染P19细胞,DMSO诱导分化第10天,免疫荧光染色检测细胞中cTnI蛋白表达情况,qPCR检测心肌分化相关标志物mRNA表达水平。双荧光素酶报告基因实验验证miR-149-3p与HSPB6之间的靶向关系。结果 与正常组比较,CHD组胎鼠出现心脏室间隔缺损,心脏组织中miR-149-3p高表达,而HSPB6低表达(P<0.01)。P19细胞在向心肌细胞分化的过程中,GATA4、cTnT、ANP和HSPB6mRNA水平均逐渐上升,而miR-149-3p表达水平逐渐下降(P<0.05)。诱导分化第10天,miR-149-3p过表达可明显降低心肌细胞分化率,并下调GATA4、cTnT、ANP mRNA表达水平(P<0.01)。双荧光素酶报告基因实验证实,miR-149-3p可以靶向调控HSPB6表达。结论 miR-149-3p可能通过靶向下调HSPB6抑制P19细胞向心肌细胞分化。

过量表达Wnt-1基因诱导P19细胞的神经分化

Wnt-1基因在小鼠神经发育过程中起着重要作用。该基因在胚胎性癌细胞P19向神经分化过程中存在瞬时性表达。利用克隆到的Wnt－1基因转染P19细胞（Wnt－1／P19），可使细胞不经视黄酸（RA）诱导，自发向神经细胞方向分化。早期神经分化关键基因MASH-1在Wnt－1／P19细胞的神经分化过程中的表达，晚于RA诱导引起的P19细胞的分化过程。

外源表达Nkx2-5基因诱导P19细胞向心肌分化

目的:构建人Nkx2-5基因融合绿色荧光蛋白真核表达质粒pEGFP-N1-Nkx2-5,探讨外源性Nkx2-5基因诱导P19细胞向心肌分化的作用。方法:以真核表达质粒pEFSA-HA-Nkx2-5为模板,PCR扩增得到人Nkx2-5基因,将目的片段亚克隆到pEGFP-N1载体,鉴定正确。将重组质粒pEGFP-N1-Nkx2-5以脂质体法转染P19细胞,G418筛选2周,聚集4d,贴壁培养16d。以免疫细胞化学检测desmin、α-sarcomeric actin和cardiac Troponin T(cTnT)的表达。结果:将Nkx2-5基因正确插入pEGFP-N1载体,外源表达Nkx2-5基因可使P19细胞在无诱导剂、聚集条件下表达desmin、α-sarcomeric actin和cTnT蛋白。结论:成功构建真核表达质粒pEGFP-N1-Nkx2-5,外源表达Nkx2-5基因诱导P19细胞向心肌分化。

应用二甲基亚砜体外诱导P19细胞分化为心肌细胞

目的观察P19细胞经二甲基亚砜(DMSO)诱导及不同培养方法,培养形成细胞聚集体并向心肌分化的过程。方法将P19细胞接种于Petri塑料培养皿或铺有0.5%软琼脂的培养皿中,DMSO诱导悬浮培养7 d形成细胞聚集体,将聚集体用生长培养基黏附培养至19 d。观察细胞跳动情况,用-αsarcomeric actinc、ardiac Troponin T(cTnT)抗体进行免疫组织化学染色,鉴定细胞分化。结果经DMSO诱导7d,将形成的细胞聚集体用生长培养基黏附培养至15 d,在聚集体周围的生长晕中出现自发性节律跳动的细胞团片,-αsarcomeric actin及cTnT染色阳性,至19d,阳性率分别可达26%和15%。结论DMSO诱导结合聚集体形成培养方法可诱导P19细胞向心肌细胞分化,并出现自发性有节律跳动。

硫辛酸烟酸二联体对丙烯醛损伤ARPE-19细胞的保护作用

目的利用丙烯醛建立年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)的细胞损伤模型,并观察硫辛酸烟酸二联体对丙烯醛诱导ARPE-19细胞损伤的保护作用。方法 MTT比色法检测ARPE-19细胞的生长周期。将25μmol·L-1、50μmol·L-1、100μmol·L-1丙烯醛加入对数生长期的ARPE-19细胞中处理24h,复制AMD细胞水平的损伤模型并确定其损伤浓度;预先加入50μmol·L-1、100μmol·L-1、150μmol·L-1硫辛酸烟酸二联体及150μmol·L-1硫辛酸预处理对数生长期细胞24h后,再加入已经确定细胞损伤模型的丙烯醛浓度处理24h,前后两次处理后均用MTT比色法检测细胞活性,HE染色法检测细胞数量和形态改变。结果 ARPE-19细胞24h内开始贴壁,4～5d细胞生长开始融合,第1-6天后生长分裂迅速进入对数生长期,6d后即开始随着时间延长活性显著下降。当丙烯醛浓度达到50μmol·L-1时,ARPE-19细胞数量明显减少,细胞肿胀、坏死,胞浆收缩、细胞核聚集;而当硫辛酸烟酸二联体浓度达到100μmol·L-1时即可以明显减少50μmol·L-1丙烯醛诱导的ARPE-19细胞活性的降低,防止凋亡小体的形成。MTT结果显示:100μmol·L-1硫辛酸烟酸二联体+丙烯醛处理组(50μmol·L-1)抗凋亡效果优于100μmol·L-1硫辛酸组,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论利用丙烯醛可以诱导ARPE-19细胞损伤来建立AMD细胞损伤的模型,硫辛酸烟酸二联体对丙烯醛诱导的ARPE-19细胞损伤具有保护作用。

应用5-氮胞苷体外诱导P19细胞分化为心肌细胞

目的探讨P19细胞体外经5-氮胞苷(5-aza)诱导向心肌细胞分化的特征。方法将P19细胞接种于铺有琼脂的培养皿中,用含不同浓度5-aza的培养基诱导培养7d,细胞悬浮生长形成类胚体(EBs)。将EBs用生长培养基黏附培养,观察细胞收缩情况;免疫细胞荧光检测α-横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin)、心肌肌钙蛋白(cTnT)的表达;RT-PCR检测GATA-4、α-MHC基因表达,鉴定细胞分化。结果将5-aza诱导形成的EBs黏附培养后,在EBs周围的生长晕中出现自发性节律收缩的细胞团片,α-sarcomeric actin及cTnT染色阳性,表达GATA-4、α-MHC基因。10μmol/L 5-aza处理组心肌细胞分化率较高。结论5-aza暴露结合悬浮培养可诱导P19细胞向心肌细胞分化,其分化与5-aza浓度有关。

金雀异黄素对缺氧诱导的人ARPE-19细胞内碱性成纤维细胞生长因子蛋白表达的影响

目的:研究低氧对体外培养的人ARPE-19细胞碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的诱导作用,以及金雀异黄素(genistein,Gen)对其表达的影响。方法:采用免疫荧光组织化学技术和激光共聚焦显微镜,以荧光比值来表示bFGF的表达,半定量分析低氧处理不同时间对体外培养的ARPE-19细胞bFGF蛋白表达的诱导作用,以及Gen对低氧诱导的bFGF表达的影响。结果:对照组有低水平bFGF蛋白的表达,随着低氧处理时间的延长,荧光比值在1h达到高峰。Gen(50,100,200μmol/L组)与二甲基亚砜(DM-SO)对照组相比,均可明显抑制低氧诱导的bFGF的表达,且这种抑制作用呈浓度依赖性。结论:Gen可抑制低氧诱导的ARPE-19细胞bFGF表达,提示Gen对视网膜新生血管的形成具有潜在的预防及治疗价值。

pEGFP-C2-GATA4真核表达载体的构建及在P19细胞中的表达

目的:构建小鼠GATA4基因融合绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C2-GATA4,并检验其在P19细胞中的瞬时表达.方法:以真核表达质粒pEFSA-GATA4为模板,PCR扩增得到小鼠GATA4基因片段,将目的片段亚克隆到pEG-FP-C2载体,卡那霉素筛选阳性克隆,经菌落PCR、酶切鉴定和测序鉴定.将重组质粒pEGFP-C2-GATA4以脂质体法瞬时转染P19细胞,用免疫细胞化学、共聚焦扫描显微镜、PCR、免疫印记法检测GATA4在P19细胞中的表达.结果:酶切、测序结果表明将基因片段GATA4正确插入pEGFP-C2载体,并可在P19细胞中检测到GATA4基因和GATA4-EGFP融合蛋白表达.结论:成功构建真核表达质粒pEGFP-C2-GATA4,并在P19细胞瞬时表达成功,为进一步研究GATA4在心脏发育中的作用奠定了基础.

Nkx2-5基因诱导P19细胞分化中心肌标志物的表达

目的研究同源框基因Nkx2-5在心肌发生中的作用。方法实验分转染组和未转染组,转染组细胞为稳定表达Nkx2-5的P19细胞,未转染组细胞为P19细胞。两组细胞悬浮培养4d,形成聚集体后贴壁培养,于贴壁培养的4、8、12、16d,免疫细胞化学检测α横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin,α-SA)和心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)的表达;RT-PCR检测GATA-4、α-肌球蛋白重链(α-myosin heavy chain,α-MHC)、心房利钠因子(atrial natriuretic factor,ANF)基因的表达。结果转染组α-SA和cTnT两种蛋白在聚集体贴壁的8、12、16d出现表达,表达量有增高趋势;16d与8d比有显著差异(P<0.01);RT-PCR结果显示:转染组GATA-4在贴壁培养的4d有表达,8、12d表达逐渐增多,16d时表达有所下降。α-MHC和ANF在贴壁培养的8d有表达,12d和16d时表达逐渐增多。统计结果表明GATA-4在8、12、16d的表达量与4d比有显著差异(P<0.05或P<0.01),α-MHC在12、16d的表达量与8d比有显著差异(P<0.05,P<0.01),ANF在16d的表达量与8d比有显著差异(P<0.01),16d表达量与12d比也有显著差异(P<0.01);未转染组结果均为阴性。结论外源表达Nkx2-5基因可诱导P19细胞逐渐表达心肌标志物。

催产素诱导P19细胞分化为心肌细胞的作用

目的研究催产素（OT）在体外诱导P19细胞分化为心肌细胞中的作用。方法将P19细胞用含OT的诱导培养基悬浮培养4d,取其形成的拟胚体（EBs）用不含OT的生长培养基贴壁培养10～12d。用免疫细胞化学、透射电镜等方法对分化的细胞进行鉴定。结果EBs周边生长晕中部分细胞变形、伸长,呈放射状排列。免疫细胞化学染色显示,变形分化的细胞表达α-横纹肌肌动蛋白（α-SCA）和心肌肌钙蛋白T（cTnT）,并以OT终浓度1×10^-7mol/L的实验组阳性率最高（P〈0.01）。透射电镜观察分化细胞具有心肌细胞发育早期的超微结构特征。结论在体外OT能够诱导P19细胞分化为早期的心肌细胞。

P19细胞体外DM SO诱导向心肌样细胞分化

目的:体外诱导P19细胞向胚胎心肌样细胞分化.方法:P19细胞经复苏、传代,在体外二甲基亚砜(DMSO)诱导下向心肌细胞分化,分化细胞经HE染色及心肌标志物转录因子(GATA-4),连接蛋白43(connecxin43),α-肌节型肌动蛋白(α-sarcomeric actin)的免疫细胞化学染色后,在光镜、倒置显微镜下观察细胞形态学变化,透射电镜下观察细胞超微结构变化.结果:经DMSO诱导分化后4 d有细胞聚集体形成,6 d有部分细胞GATA-4和connecxin43呈阳性表达,GATA-4阳性表达位于细胞核和细胞质,connecxin43阳性表达呈斑点状分布于心肌细胞胞质内和细胞膜表面.10 d时GA-TA-4和connecxin43阳性表达明显增加,并有部分细胞呈α-sarcomeric actin阳性,阳性表达位于细胞质.电镜观察,未分化细胞为圆形或椭圆形,细胞间连接松散,细胞质较少,细胞器不发达;诱导后6 d,细胞间出现紧密连接和中间连接,细胞质增多,部分细胞表面出现突起,突起内可见微丝.诱导后10d,线粒体、粗面内质网、滑面内质网、高尔基体丰富,并有中心粒形成.结论:P19细胞在DMSO诱导下已有向心肌分化趋向,有类似胚胎心肌细胞形成.

P19细胞向神经元诱导分化的实验研究

目的 探讨P19细胞向神经元定向分化发育的可能性。 方法 经维甲酸 (RA)诱导 4d的P19细胞按神经细胞培养方法培养 12d ,分别用NSE、MAP 2和TH进行免疫组织化学染色 ,用AchE进行组织化学染色 ,鉴定分化细胞的特征。 结果 经RA诱导的P19细胞培养 12d ,大多数细胞转变为类似于神经元的形态 ,长出突起并相互联络成网。经NSE免疫组织化学显示 ,12d培养物中神经元约占 89%。P19诱导的神经元培养 12d ,神经元突起经MAP 2染色呈阳性反应。TH免疫组织化学显示 ,神经元中TH染色阳性神经元约占 0 8%。组织化学显示 ,神经元中AchE染色阳性神经元约占 71 0 9%。

CCK-8法检测蓝光和白光对ARPE-19细胞增殖的影响

目的:探讨蓝光和白光分别光照不同时间对人视网膜色素上皮(ARPE-19)细胞增殖的影响,为进一步检测光照损伤过程中相关因子的变化情况,研究光照损伤过程中的信号转导机制奠定基础。方法:收集生长状态良好的ARPE-19细胞进行实验,制作CCK-8标准曲线,确定实验合适的ARPE-19细胞密度及CCK-8试剂的反应时间。将细胞分为避光组、蓝光组、白光组,分别光照3、6、9h,再避光培养12h后采用CCK-8法检测不同光源光照不同时间对ARPE-19细胞增殖率的影响。结果:通过CCK-8标准曲线选择每孔细胞数量为20000个,CCK-8溶液作用4h后测量相应吸光度值。CCK-8检测结果示,避光组、蓝光组、白光组三组细胞光照不同时间细胞增殖率比较,差异有统计学意义(P<0.01)。蓝光组细胞光照3、6、9h,各时间点细胞增殖率比较,差异有统计学意义(P<0.001),且随着光照时间的延长,细胞增殖率逐渐降低。白光组细胞光照3、6、9h,各时间点细胞增殖率比较,差异有统计学意义(P<0.05),其中光照3h和6h细胞增殖率比较,差异有统计学意义(P<0.05),而光照9h分别与光照3、6h细胞增殖率比较,差异均无统计学意义(P=0.253、0.120)。白光光照3～6h细胞增殖率呈下降趋势,而光照6～9h细胞增殖率呈现上升趋势。相同光照时间,蓝光组和白光组细胞增殖率均低于避光组,且蓝光组细胞增殖率均低于白光组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:光照能抑制ARPE-19细胞的增殖,其中蓝光光照细胞增殖率明显低于白光,且随光照时间的增长,细胞增殖率进一步降低。

苯丙氨酸及其代谢物影响P19细胞神经分化的形态学研究

本研究通过免疫组化及活细胞计数法研究了苯丙氨酸及其代谢物对 P19细胞神经分化的影响。结果显示 :在 P19细胞神经分化诱导期加入苯丙氨酸及其代谢物可降低 P19神经元存活率 ,导致 P19神经元肿胀、崩解 ,神经突起纤细且分支少 ,神经纤维丝蛋白的染色性降低 ,同时发现 P19神经元中多极神经元 /单双极神经元的比例下降。本研究表明 ,苯丙氨酸及其代谢物可影响 P19细胞的神经诱导和分化 。

内皮素1调控P19细胞向心脏传导细胞分化的机制

背景:内皮素1作为一种来源于心内膜和动脉血管内皮的旁分泌信号,能够诱导心脏传导细胞的分化成熟。目的:探讨内皮素1在体外诱导P19细胞向心脏传导细胞分化的作用。方法:P19细胞分别与1%二甲基亚砜和100 nmol/L浓度内皮素1孵育,通过Western blot、免疫荧光和qR T-PCR鉴定早期心肌细胞特征性转录因子GATA4、MEF2C和心肌细胞分化标志物MHC-α、cTnT,以及重要的传导细胞转录因子Nkx2.5、Tbx5和分化标志物Cx40、ANP的变化。qRT-PCR鉴定内皮素1特异性受体阻断剂和阻断PI3K-AKT-mTOR信号通路对内皮素1诱导P19细胞分化的影响。结果与结论:(1)内皮素1能够上调P19细胞早期心肌转录因子、心肌结构基因和传导系统特征表型表达;(2)与二甲基亚砜相比,内皮素1能够确实诱导P19细胞向心脏传导细胞分化;(3)内皮素1主要通过ETA通路上调Nkx2.5和Cx40表达水平从而诱导P19细胞向传导细胞分化,ETB通路可能还参与了一条负反馈调节通路;(4)内皮素1能够通过PI3K-AKT-mT OR信号通路调控Nkx2.5表达进而影响传导细胞分化。