食品中残留19-去甲睾酮免疫原的合成与鉴定

19-去甲睾酮(19-nortestosteroneNT),属于半抗原生物小分子,具有免疫反应性,但不具有免疫原性。本文中19-去甲睾酮经羧甲基羟胺肟化,质谱(MS)检验后,采用混合酸酐法将肟化产物与牛血清蛋白(bovineserumalbuminBSA)偶联,紫外分光光度法测定其交联率为24。用此合成产物进行动物体免疫,获得了NT的多克隆抗体。经间接酶联免疫测定,其抗血清的稀释度可以达到1:102400,证明诺龙免疫原的合成成功,为诺龙酶联免疫试剂盒的研究奠定基础。

动物组织中19-去甲睾酮残留量的气相色谱-质谱检测

本工作建立了动物组织中19-去甲睾酮的残留分析方法。动物组织在缓冲溶液中酶解，用甲醇提取，正己烷去脂，提取液经SPE-C18小柱净化，衍生化反应后在气相色谱-质谱仪（GC／Ms）上以选择离子的方式进行定性定量分析。回收率为82％～93％，变异系数〈10％，最低定量检出限为1．0μg·kg^-1。该方法高效、准确、灵敏，并满足食品中兽药检测要求。

19-去甲睾酮免疫学检测方法的筛选和优化

目的:19-去甲睾酮列为运动员和动物竞技比赛中的违禁药品,也禁止其以促进生长为目的在食源性动物生产中使用,该文研究其免疫学快速检测方法的筛选。方法:间接ELISA检测不同免疫时间对效价的影响,间接竞争ELISA研究同源和异源性检测对抗体灵敏度的影响,不同孵育时间选择最佳检测方案。结果:NT-17-BSA为完全抗原制备兔多克隆抗体,以NT-3-OVA为包被原进行异源性ELISA检测,结果表明五免后可制备出高效价的NTpAb(1∶25600),并获得最灵敏的IC50值(18ng/mL)。同时,37℃条件下,2h包板和1h封闭的孵育方案获得最理想的吸光度值。结论:该研究所建立的检测方法可应用于19-去甲睾酮免疫学快速检测试剂盒的研制。

19-去甲睾酮对性腺发育不良小鼠附性腺生长的影响

目的 :观察合成同化甾体激素 19 去甲睾酮 (NT)对性腺发育不良 (hpg)小鼠的前列腺、精囊腺 (SV)、附睾生长发育的影响 ,为用药的安全性提供实验依据。 方法 :NT硅胶囊皮下埋植 5周缓释给药 ,设给药hpg小鼠实验组 (n =7)、不给药hpg小鼠对照组 (n =7)和性腺发育正常小鼠对照组 (n =10 )。给药结束后测定前列腺腹侧叶(VP)、SV和附睾的重量及VP腺管末梢数目。 结果 :与hpg小鼠对照组相比 ,hpg小鼠给药组各附性腺的重量均显著增加 (P <0 .0 0 5 ) ,VP腺管分支形态发育趋于正常 ;hpg小鼠给药组SV的重量与正常小鼠相同 ,但VP、附睾的重量及VP腺管末梢数目仍显著低于正常性腺小鼠对照组 (P <0 .0 0 5 )。 结论

一种制备19-去甲睾酮完全抗原及单克隆抗体的方法的建立

本文旨在建立一种制备19-去甲睾酮完全抗原及单克隆抗体的方法。通过丁二酸酐将19-去甲睾酮（19BNT）半抗原与牛血清白蛋白（BSA潲联得到偶联物（19BNT—HAS—BSA），以此进行免疫、筛选，最终获得3株阳性杂交瘤细胞（4D5，6F2，7E7），并制得相应的单克隆抗体。用间接竞争酶联免疫法，对7E7株抗体进行鉴定，发现：抗体的亲和常数为3．35×108L／mol，半抑制浓度为0．35ng／mL，表明此抗体对19-去甲睾酮有很强的亲和力；以19-去甲睾酮为参照物，抗体对丙酸诺龙的交叉反应率为80．3％，对甲基睾酮、睾酮、群勃龙、己烯雌酚等的交叉反应率均小于0．2％，表明此抗体具有良好的特异性。由此可知，7E7株抗体可用于对19-去甲睾酮、丙酸诺龙的免疫分析。

19-去甲睾酮单克隆抗体的筛选及icELISA方法的建立

采用细胞融合技术筛选抗19-去甲睾酮(nortestosterone,NT)单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)杂交瘤细胞株,体内诱性腹水法制备NT mAb,建立异源性间接竞争ELISA(indirect competitive ELISA,icELISA)标准曲线,并对其特异性、理化因素的影响和基质效应性进行探讨.结果表明,筛选的5株杂交瘤细胞分泌的单抗腹水效价为0.64×105～2.56×105,半数抑制浓度IC50为0.55～1.0ng/mL,抗体为IgG1亚型,具k轻链,亲和常数Ka为2.6×109～4.7×109L/mol.建立的icELISA标准曲线在磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)中的线性检测范围为0.004～85.8ng/mL,IC50值为0.55ng/mL,检测限(limit of detection,LOD)为0.002ng/mL;抗体与17a-去甲睾酮的交叉反应率(cross-reactivity,CR)为62%,与其他化合物无CR.标准品稀释液中甲醇的最佳含量为10%,牛尿1:20倍稀释可消除基质干扰,ELISA方法和液质联用检测(LC-MS/MS)的相关性良好(R2=0.9871).

19-去甲睾酮异源性ciELISA试剂盒的研制及应用

筛选抗19-去甲睾酮(NT)单克隆抗体,建立异源性ciELISA试剂盒。用人工抗原NT-17-BSA免疫Balb/C小鼠,细胞融合技术建立1株抗NT单克隆杂交瘤细胞NT1-B7,同种型为IgG1/k,腹水效价达0.64×105,亲和常数(Ka)为4.31×109L/mol,半数抑制浓度(IC50)为0.55ng/ml,与群勃龙和雌二醇的交叉反应率(CR)分别为2.2%和1.6%,与其它化合物无CR。异源性ciELISA试剂盒在猪肉、猪尿、牛肉和牛尿四种基质中的检测限分别为0.24ng/ml、0.23ng/ml、0.22ng/ml和0.17ng/ml,批内和批间相对标准差(RSD)在4.4%～21.8%,添加回收率在85%～110%,4℃下保存期至少6个月。NT-Kit的基质pH适用范围为6.5～7.5,温育过程优化后可节约检测时间30～90min。试剂盒灵敏度高、特异性强,可应用于样品基质中NT残留检测。