骨髓间充质干细胞来源的miR-199a-5p通过抑制ZIK1/MAP3K11调节肾细胞癌细胞的增殖和侵袭

目的:研究骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)来源的外泌体(exsome)中miR-199a-5p对肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)细胞增殖和侵袭的影响。方法:分离骨髓间充质干细胞来源的外泌体(BM-MSCs-Exo),电子显微镜观察外泌体形态,Western blot方法检测外泌体标志蛋白CD9和CD63。CCK-8法检测RCC细胞在不同条件下的增殖速度,Transwell法检测RCC细胞的侵袭能力,q-PCR法检测miR-199a-5p以及ZIK1和MAP3K11的mRNA表达,双荧光素酶实验验证miR-199a-5p以及ZIK1和MAP3K11基因的3’UTR区域靶向结合。结果:BM-MSCs-Exo电镜下呈圆形囊泡状,直径约100 nm,且高表达CD9和CD63,RCC细胞摄取BM-MSCs-Exo后增殖和侵袭能力均被抑制,过表达miR-199a-5p的BM-MSCs-Exo能显著抑制RCC细胞的增殖和侵袭能力,抑制BM-MSCs-Exo中的miR-199a-5p后能缓解BM-MSCs-Exo对RCC的抑制作用,且发现过表达miR-199a-5p的BM-MSCs-Exo能显著降低ZIK1和MAP3K11的mRNA表达,而在BM-MSCs-Exo中抑制miR-199a-5p有相反作用。结论:BM-MSCs-Exo通过向RCC细胞转运miR-199a-5p抑制ZIK1和MAP3K11的表达,进而抑制RCC细胞的增殖和侵袭。

微小RNA-199a-5p保护大鼠脑缺血后血-脑屏障完整性

目的探讨微小RNA(miR)-199a-5p保护脑缺血后血-脑屏障(BBB)完整性的机制。方法通过SPF级成年雄性SD大鼠建立永久性大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,48只大鼠随机分为假手术组、模型组、MCAO+miR-199a-5p组和MCAO+miR-199a-5p阴性对照组,每组12只。应用Ludmila Belayev 12分评分法评估大鼠的神经行为学表现;采用Evans蓝染色检测脑缺血后BBB的完整性;免疫荧光染色检测脑缺血后细胞凋亡;Western blotting技术检测claudin-5、磷脂酰肌醇-3激酶调节亚基2(PIK3R2)、p-Akt、Akt和血管内皮生长因子(VEGF)-A的蛋白表达;利用Real-time PCR检测脑缺血半暗带、梗死区miR-199a-5p、claudin-5及VEGF-A表达水平。结果MiR-199a-5p mimic干预增强MCAO大鼠本体感觉和运动能力。MiR-199a-5p降低脑缺血后PIK3R2的表达,激活Akt信号通路,并增加缺血半暗带中claudin-5和VEGF-A的表达。此外,miR-199a-5p减轻了脑缺血后的炎症。MiR-199a-5p降低脑缺血后BBB渗透性,减少神经细胞凋亡。结论MiR-199a-5p可降低缺血性脑卒中后PIK3R2的表达,激活Akt信号通路,降低炎性细胞因子的表达,减轻缺血性脑卒中对BBB的破坏。

miR-199a-5p通过调节肠道菌群促进胆总管结扎诱导的大鼠肝纤维化

目的研究miR-199a-5p通过调节肠道菌群对胆总管结扎(BDL)诱导的大鼠肝纤维化的影响。方法25只SD大鼠随机分为Sham组、BDL组、空载腺病毒(NC adv)组、miR-199a-5p adv组和miR-199a-5p sponge adv组,每组5只。HE、Masson和Sirius Red染色观察大鼠肝组织病理变化及肝纤维化程度;全自动生化分析仪检测大鼠血清中天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、总胆红素(TBIL)和直接胆红素(DBIL)含量;qRT-PCR检测大鼠肝组织中miR-199a-5p的表达水平;双重免疫荧光和Western blot实验检测大鼠肝组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和I型胶原α1链(COL1A1)的蛋白表达水平;收集大鼠粪便进行16S rRNA高通量测序。结果miR-199a-5p在BDL大鼠肝组织中表达上调(P<0.01)。与NC adv组相比,miR-199a-5p adv组大鼠肝损伤及胶原沉积现象更为严重,血清中AST、ALT、TBIL和DBIL含量以及肝组织中α-SMA和COL1A1表达水平显著升高(均P<0.05)。然而,miR-199a-5p sponge adv干预的结果与之相反(均P<0.05)。16S rRNA测序结果显示,miR-199a-5p adv干预可增加BDL大鼠肠道菌群的多样性和丰富度,改变肠道菌群组成,而miR-199a-5p sponge adv干预后菌群的结果与之相反(均P<0.05)。结论miR-199a-5p促进BDL大鼠肝纤维化,其机制可能与调节肠道菌群多样性和丰度相关。

miR-199a-5p在肝脏组织中的表达及其作用的初步研究

目的:探究不同营养状态下miR-199a-5p在肝脏中的表达水平,以及其对肝细胞甘油三酯(triglyceride,TAG)含量的影响及其潜在机制。方法:RT-qPCR检测高脂饮食小鼠肝脏组织中miR-199a-5p的表达;分别使用miR-199a-5p模拟物、抑制剂、阴性对照和pcDH-CD36-flag质粒转染Hepa1-6和AML12细胞,通过RT-qPCR和Western blot检测脂代谢相关标志物表达变化,采用试剂盒检测TAG含量;通过miRDB(microRNA Target Prediction Database)预测miR-199a-5p的靶基因并通过双荧光素酶报告实验进行验证。结果:高脂饮食和饥饿状态下C57BL/6J小鼠肝脏中miR-199a-5p的表达水平升高;过表达miR-199a-5p能够降低肝细胞内TAG,而miR-199a-5p抑制剂会增加细胞内TAG含量;miR-199a-5p通过作用于脂肪酸转位酶CD36基因的3′非翻译区(3′untranslated region,3′UTR)降低其蛋白表达。结论:在肝脏脂质积累过程中,miR-199a-5p的表达水平增加,并且miR-199a-5p可能通过靶向CD36降低肝细胞内TAG含量。

血清miRNA-199a-5p、α-1-B-糖蛋白反义RNA1水平与脑胶质瘤患者术后复发的关系

目的检测脑胶质瘤患者的血清微小RNA(miRNA)-199a-5p、α-1-B-糖蛋白反义RNA1(A1BG-AS1)水平,并分析其与患者术后复发的关系。方法选取94例接受手术治疗的脑胶质瘤患者和84例健康体检者,分别作为研究组和对照组。术后所有脑胶质瘤患者均随访2年,依据是否复发分为复发组(n=71)和非复发组(n=23)。采用聚合酶链反应(PCR)检测血清miRNA-199a-5p、A1BG-AS1水平,比较研究组和对照组、复发组和非复发组的血清miRNA-199a-5p、A1BG-AS1水平。采用Spearman相关分析法分析血清miRNA-199a-5p、A1BG-AS1水平与脑胶质瘤患者术后复发的相关性。绘制受试者工作特征(ROC)曲线,计算曲线下面积(AUC),分析血清miRNA-199a-5p、A1BG-AS1单独及联合检测对脑胶质瘤患者术后复发的评估价值。结果研究组患者血清miRNA-199a-5p水平明显低于对照组,血清A1BG-AS1水平明显高于对照组,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。复发组患者血清miRNA-199a-5p水平低于非复发组,血清A1BG-AS1水平高于非复发组,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。血清miRNA-199a-5p水平与脑胶质瘤患者术后复发呈负相关(r=-0.382,P﹤0.05),血清A1BG-AS1水平与脑胶质瘤患者术后复发呈正相关(r=0.423,P﹤0.05)。ROC曲线显示,血清miRNA-199a-5p、A1BG-AS1联合检测评估脑胶质瘤患者术后复发的AUC和灵敏度均高于二者单独检测。结论脑胶质瘤患者血清miRNA-199a-5p水平降低,血清A1BG-AS1水平升高,且其表达水平与脑胶质瘤患者术后复发有关,联合检测对术后复发具有较好的评估价值。

LncRNA LUCAT1通过靶向miR-199a-5p调控宫颈癌细胞活性、侵袭迁移及其分子机制

目的研究长链非编码RNA肺癌相关转录产物(LUCAT)1对宫颈癌细胞的活性、迁移和侵袭的影响,并探讨其机制。方法运用qRT-PCR法检测宫颈癌细胞Hela、正常宫颈细胞Ect1/E6E7中LUCAT1、miR-199a-5p的表达;将si-con组(转染si-con)、si-LUCAT1组(转染si-LUCAT1)、miR-199a-5p组(转染miR-199a-5p模拟物)、miR-NC组(转染miR-NC)、si-con+anti-miR-199a-5p组(共转染si-con和anti-miR-199a-5p)、si-LUCAT1+anti-miR-199a-5p组(共转染si-LUCAT1和anti-miR-199a-5p),均用脂质体法转染至Hela细胞;噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞的活性;Transwell法检测各组细胞的迁移和侵袭;双荧光素酶报告基因检测实验检测各组细胞的荧光活性。结果与正常宫颈细胞Ect1/E6E7相比,宫颈癌细胞Hela中LUCAT1表达显著升高,miR-199a-5p表达显著降低;敲减LUCAT1、过表达miR-199a-5p均可明显抑制Hela细胞的活性、迁移和侵袭;miR-199a-5p可抑制野生型LUCAT1细胞的荧光活性,且LUCAT1可负向调控miR-199a-5p的表达;抑制miR-199a-5p可逆转敲减LUCAT1对Hela细胞的活性、迁移、侵袭的抑制作用。结论LUCAT1可促进宫颈癌细胞的活性、迁移、侵袭,其机制可能与靶向miR-199a-5p有关,将可为宫颈癌的治疗提供靶点。

七氟烷预处理上调miR-199a-5p对脊髓缺血/再灌注损伤的保护作用

目的研究miR-199a-5p在七氟烷预处理大鼠脊髓缺血/再灌注损伤(SCIRI)中的作用。方法将24只SD大鼠随机分为:假手术组(Sham组)、模型组(I/R组)、七氟烷+模型组(SEVO+I/R组)。Sham组给予同样的手术,但不吸入七氟烷或夹闭主动脉弓;I/R组无创动脉夹夹闭主动脉弓14 min后再灌注,以建立SCIRI模型;SEVO+I/R组,建立SCIRI模型前吸入2.4%的七氟烷3 h。Basso Beattie Bresnahan评分法评价神经运动功能;TUNEL染色观察细胞凋亡情况;伊文思蓝(EB)测定血-脊髓屏障(BSCB)通透性;realtime qPCR检测miR-199a-5p含量;Western blot测定脊髓组织中caspase-9和Bcl-2水平。结果与假手术组比较,I/R组神经运动功能评分降低,细胞凋亡率增加,BSCB通透性增加,miR-199a-5p表达降低,caspase-9表达增加,Bcl-2表达减少;与I/R组比较,SEVO+I/R组神经运动功能评分增加,细胞凋亡率减少,BSCB通透性减少,miR-199a-5p表达增加,caspase-9表达减少,Bcl-2表达增加。结论七氟烷预处理可能通过增加miR-199a-5p,减少BSCB通透性及细胞凋亡,保护大鼠SCIRI。

miRNA-199a-5p通过SP1调节ERK5抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭的机制

目的探讨miR-199a-5p对乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭影响及其作用机制。方法转染miR-199a-5p mimic至MDA-MB-231细胞,Transwell侵袭实验检测miR-199a-5p对MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响。采用细胞免疫荧光、Western blot法检测上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)分子标志物E-cadherin、vimentin的表达。应用Western blot法检测miR-199a-5p mimic及其LNA-siRNA对ERK5、p ERK5、EGF、SP1表达的影响。染色体免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,CHIP)技术检测SP1是否与ERK5启动子区结合。结果 miR-199a-5p能抑制MDA-MB-231细胞的侵袭,降低vimentin的表达,增强E-cadherin的表达。同时,miR-199a-5p降低ERK5表达并抑制其磷酸化;EGF、SP1的表达也相应减少。相反,应用LNA-siRNA抑制miR-199a-5p后,ERK5、p ERK5、EGF、SP1的表达上调。CHIP结果显示SP1能与ERK5启动子区结合。结论 miR-199a-5p通过调节EGF、SP1下调ERK5的表达并抑制其磷酸化,进而发挥对乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭的抑制作用。

MiR-199a-5p通过靶向DRAM1调控急性髓系白血病对阿柔比星的敏感性

目的:比较miR-199a-5p在急性髓系白血病(AML)耐药细胞株K562/ADM以及敏感细胞株K562中的表达,研究其对AML耐药的调控效应并探索其机制。方法:采用MTT法检测阿柔比星(ADM)对K562/ADM和K562细胞的生长抑制率并计算IC50。采用实时荧光定量RT-PCR的方法检测2种细胞株(K562/ADM和K562)以及患者骨髓标本(复发难治AML患者和化疗后完全缓解AML患者)中miR-199a-5p的表达。通过细胞转染的方法在K562/ADM细胞中转入miR-199a-5p mimic使其表达上调,在K562细胞中转入miR-199a-5p inhibitor使其表达下调,采用CCK-8法检测ADM对2种细胞的增殖抑制率,实时荧光定量PCR和Western blot法分别检测转染后2种细胞中DRAM1基因和蛋白的表达。双荧光素酶报告基因实验检测miR-199a-5p与DRAM13′UTR是否存在直接结合位点。采用siRNA的方法下调K562/ADM细胞中DRAM1表达,CCK-8法检测ADM对细胞增殖抑制率的变化。结果:ADM对K562/ADM和K562细胞的IC50分别为146.14±0.079和3.08±0.056μg/ml。miR-199a-5p在复发难治AML患者骨髓中的表达明显低于完全缓解患者,在K562/ADM细胞中的表达明显低于K562细胞(P<0.05)。当K562/ADM细胞中miR-199a-5p表达上调时,ADM对细胞的增殖抑制率升高,DRAM1基因和蛋白表达明显下降。当K562细胞中miR-199a-5p表达下调时,ADM对细胞的增殖抑制率明显下降,DRAM1基因和蛋白表达明显升高(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验显示,miR-199a-5p与DRAM1的3′UTR区存在直接结合位点。K562/ADM细胞中DRAM1在基因和蛋白水平表达均明显高于K562细胞(P<0.05)。当K562/ADM细胞中DRAM1基因表达下调后,细胞对ADM的敏感性显著升高(P<0.05)。结论:miR-199a-5p在耐药白血病细胞中呈低表达。miR-199a-5p表达能够调控AML细胞对ADM的敏感性。DRAM1是miR-199a-5p调控AML耐药的功能性靶基因。

MicroRNA-199a-5p和HIF-1α在慢性阻塞性肺疾病上皮细胞中的表达及相关性

目的研究慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者经肺泡灌洗获得上皮细胞中MicroRNA-199a-5p和缺氧诱导因子(HIF)-1α的表达水平,探讨其与疾病分期和严重程度的相关性及两者间的表达关系,为疾病的发生机制提供参考。方法选择2018年5月至2019年5月入该院诊断COPD患者共120例,其中稳定期80例,急性发作期40例,根据肺功能检测分为轻度30例,中度60例,重度30例;经肺泡灌洗获得上皮细胞,并鉴定细胞形态,然后采用实时荧光定量PCR法检测细胞MicroRNA-199a-5p和HIF-1αmRNAs表达水平,分析不同疾病分期和严重程度患者间MicroRNA-199a-5p和HIF-1αmRNAs表达的差异性,以及两者间的相关性。结果急性期患者上皮细胞MicroRNA-199a-5p和HIF-1αmRNAs表达水平显著高于稳定期,重度患者高于中度,中度患者高于轻度,差异有统计学意义(P<0.05)。经Pearson相关分析发现,MicroRNA-199a-5p和HIF-1αmRNAs表达水平呈显著正相关(r=0.856,P=0.003)。结论COPD患者上皮细胞MicroRNA-199a-5p和HIF-1α表达上调与疾病分期和严重程度密切相关,两者可能发挥协同作用关系。

MicroRNA-122-5p与MicroRNA-199a-5p在EMS患者血清的表达及临床意义

目的探讨micro RNA-122-5p(mi R-122-5p)与micro RNA-199a-5p(mi R-199a-5p)在子宫内膜异位症(EMS)患者血清的表达及临床意义。方法前瞻性设计,随机选取2016年1月—2017年12月华北石油管理局总医院诊治的EMS患者90例(EMS组)及同期不孕症检查的患者70例(对照组)为研究对象。分别采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)及酶联免疫吸附试验(ELISA)检测两组人群血清的mi R-122-5p和mi R-199a-5p的表达及白细胞介素-6(IL-6)的表达,并分析其与临床特征的相关性。构建受试者操作特征(ROC)曲线。结果 EMS组患者的血清及腹腔液中IL-6、miR-122-5p、miR-199a-5p的表达与对照组比较,差异有统计学意义(P <0.05),EMS组均增高。miR-122-5p的表达与IL-6水平(r=0.578,P <0.05)、miR-199a-5p表达(r=0.721,P <0.05)呈正相关。miR-199a-5p的表达与IL-6水平(r=0.562,P<0.05)呈正相关。miR-122-5p和miR-199a-5p检测EMS的敏感性分别为94.7%和92.1%,特异性分别为90.5%和88.6%。结论血清miR-122-5p和miR-199a-5p在EMS患者中的表达增加,miR-122-5p与miR-199a-5p有成为诊断子宫内膜异位症的生物标志物的潜力。

用双萤光素酶报告基因技术验证小鼠lncRNA-H19与miR-199a-5p的靶向关系

目的:构建长链非编码RNA-H19(lncRNA-H19)萤光素酶报告质粒,利用双萤光素酶报告基因技术验证小鼠lncRNA-H19与微小RNA-199a-5p(miR-199a-5p)的靶向关系。方法:通过生物信息学网站RegRNA2.0预测获取小鼠lncRNA-H19与miR-199a-5p潜在的互补结合位点。将H19及其突变体克隆到萤光素酶载体psi CHECK-2中,构建H19野生型和突变型质粒,并采用酶切和测序方法鉴定psi CHECK-2-H19载体是否构建成功。将H19野生型和突变型质粒分别与miR-199a-5p模拟物、miR-199a-5p抑制剂、miR-199a-5p模拟物阴性对照或miR-199a-5p抑制剂阴性对照在293T细胞中共转染。收集细胞后通过双萤光素酶报告系统检测不同组别的萤光素酶活性,从而对lncRNA-H19与miR-199a-5p的靶向调节关系进行验证。结果:构建的重组萤光素酶报告质粒经酶切及测序鉴定正确,双萤光素酶报告基因检测显示,与miR-199a-5p模拟物阴性对照组相比,miR-199a-5p模拟物组H19野生型报告基因的萤光素酶活性显著降低,下降约49%左右(P<0.01),而miR-199a-5p抑制剂组H19野生型报告基因的萤光素酶活性较miR-199a-5p模拟物组明显增高(P<0.01)。miR-199a-5p模拟物、miR-199a-5p抑制剂、miR-199a-5p模拟物阴性对照以及miR-199a-5p抑制剂阴性对照对H19突变型的萤光素酶活性均无明显影响。结论:lncRNA-H19能够靶向结合miR-199a-5p,并在转录后水平对其有直接抑制作用。

lncRNA LUCAT1通过靶向调控miR-199a-5p/HIF-1α促进肾透明细胞癌786-O细胞的增殖和迁移

目的:探讨长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)肺癌相关转录物1(lung cancer associated transcript 1,LUCAT1)对肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)786-O细胞的增殖和迁移能力的影响及其作用机制。方法:选取2013年6月至2017年6月宜昌市第一人民医院泌尿外科行手术切除的40例ccRCC患者癌组织及相应的癌旁组织样本,组织均经病理检查诊断明确。ccRCC细胞株786-O、ACHN、UM-RC-2及正常肾上皮细胞系KiMA培养完成后,用qPCR法检测cc RCC组织和细胞株中miR-199-a-5p、HIF-1α和LUCAT1T mRNA的表达,用CCK-8实验检测786-O细胞的增殖能力,Transwell法检测786-O细胞的迁移能力,双荧光素酶报告基因实验验证LUCAT1与miR-199a-5p的靶向作用关系,Western blotting实验检测LUCAT1、miR-199a-5p对HIF-1α蛋白表达的影响。结果:LUCAT1在ccRCC组织和细胞系786-O、ACHN和UM-RC-2中呈高表达(均P<0.01),敲低LUCAT1后可明显抑制786-O细胞的增殖和迁移(均P<0.01)。miR-199a-5p在ccRCC组织和细胞系中呈低表达(均P<0.01),StarBase数据库分析结果显示LUCAT1含有miR-199a-5p的保守目标位点,miR-199a-5p对LUCAT1-Wt的报告活性具有明显的抑制作用(P<0.01);敲低LUCAT1可明显降低miR-199a-5p的表达(P<0.01)。LUCAT1在转染miR-199a-5p模拟物的786-O细胞中呈低表达,但在LUCAT1+miR-199a-5p模拟物共转染的786-O细胞中出现逆转(P<0.05或P<0.01)。转染miR-199a-5p模拟物的786-O细胞中HIF-1αmRNA和蛋白表达水平升高,而LUCAT1过表达可逆转该效应(P<0.05或P<0.01)。转染miR-199a-5p模拟物抑制786-O细胞的增殖和迁移,而转染LUCAT1可部分消除转染miR-199a-5p模拟物对786-O细胞增殖和迁移的影响(P<0.05或P<0.01)。结论:lncRNA LUCAT1通过靶向调节miR-199a-5p/HIF-1α的表达从而在ccRCC中发挥促癌效应。

Caveolin-1和miR-199a-5p在缺血性脑卒中患者外周血及模型大鼠脑组织、脾脏中的表达及其意义

目的探讨缺血性脑卒中(IS)患者外周血及模型大鼠脑组织、脾脏中miR-199a-5p和膜微囊蛋白(Cav)-1的表达水平及临床意义。方法初发IS患者(发病24 h内)外周血标本24例,同时收集在体检中心体检的健康人外周血标本22例。Ficoll淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)。荧光定量PCR检测PBMC中miR-199a-5p和Cav-1的表达水平。采用改良Zea Longa线栓法构建SD大鼠大脑中动脉梗死(MCAO)模型。再灌注24 h后进行神经功能评分,收集脑皮质和脾脏组织。荧光定量PCR检测脑皮质和脾脏miR-199a-5p和Cav-1表达水平。结果 IS患者外周血PBMC中miR-199a-5p表达明显升高(P<0.001),Cav-1 mRNA表达显著下降(P<0.05)。与假手术组比较,MCAO模型组脑皮质和脾脏miR-199a-5p明显升高(P<0.001,P<0.01),Cav-1 mRNA表达显著下降(P<0.001,P<0.01)。结论 miR-199a-5p和Cav-1可能为IS患者重要的炎症指标。

miR-199a-5p调控DDR1抑制人脑胶质瘤细胞增殖和迁移

目的初步探究miR-199a-5p对人脑胶质瘤细胞增殖和迁移的影响。方法选取U251细胞为实验对象,构建miR-199a-5p过表达U251细胞株。实验分组:对照组(无转染的U251细胞,Control)、阴性对照组(转染空载体质粒U251细胞,NC)以及实验组(转染miR-199a-5p成熟模拟物,mimics)。实时荧光定量PCR检测各组细胞miR-199a-5p表达;CCK-8检测转染miR-199a-5p后细胞增殖;细胞划痕实验与Transwell迁移实验检测各组U251迁移情况;Western blot检测DDR1表达;构建DDR1过表达U251细胞株,检测DDR1过表达对转染miR-199a-5p的U251细胞增殖和迁移的影响。结果mimics组细胞miR-199a-5p水平高于control组(P<0.01),细胞活力降低(P<0.01),增殖能力减弱(P<0.01)。转染miR-199a-5p组细胞DDR1表达水平降低(P<0.01)。与mimins组相比,转染pcDNA3.1-DDR1组能够上调DDR1(P<0.01),增加细胞活力,促进细胞增殖(P<0.05或P<0.01)。结论miR-199a-5p能够下调DDR1表达,抑制人脑胶质瘤细胞增殖和迁移。

柚皮苷调控miR-199a-5p/ECE1分子轴促进骨损伤修复

目的探讨柚皮苷通过调控mi R-199a-5p/ECE1分子轴对骨损伤修复的影响。方法 Western blotting检测ECE1及成骨分化相关标志物的表达水平;RT-qPCR检测mi RNAs相对表达水平;双荧光素酶报告基因验证mi R-199a-5p和ECE1靶向关系;MTT检测MC3T3-E1细胞增殖活力;碱性磷酸酶(ALP)检测MC3T3-E1细胞成骨分化能力;茜素红染色检测MC3T3-E1细胞矿化情况。结果柚皮苷处理显著促进MC3T3-E1细胞增殖活力、成骨分化指标Runx2、OPN、BMPs、OC等的表达、ALP活性以及细胞钙化能力水平(P<0.01)。其中20ng/m L浓度处理的效果最优。RT-qPCR检测结果显示,柚皮苷能显著上调mi R-199a-5p的表达水平。双荧光素酶报告基因检测结果表明ECE1是mi R-199a-5p的一个靶基因;并且,mi R-199a-5p靶向下调ECE1的表达。进一步实验表明,敲降mi R-199a-5p显著降低柚皮苷对MC3T3-E1细胞增殖活力、ALP活性和钙矿化的促进作用(P<0.01);敲降ECE1显著促进了柚皮苷对MC3T3-E1细胞增殖活力、ALP活性和生物矿化能力的促进作用(P<0.01);柚皮苷处理加同时敲降mi R-199a-5p和ECE1组MC3T3-E1细胞增殖活力、ALP活性和钙矿化能力与柚皮苷组无显著差异(P>0.05)。对细胞成骨分化标志的检测也证明了上述结果。由此可知,柚皮苷通过上调mi R-199a-5p对ECE1靶向下调作用,进而促进MC3T3-E1细胞增殖活力、成骨分化和矿化能力。结论柚皮苷处理显著促进了MC3T3-E1细胞的成骨分化水平;这种作用是通过上调mi R-199a-5p/ECE1分子轴实现的。

下调miRNA-199a-5p靶向HIF1α激活JAK/STAT3通路促进乳腺癌细胞增殖与恶性转移

目的:探讨miRNA-199a-5p在乳腺癌MCF-7细胞中的表达及其对细胞增殖与恶性转移的影响。方法:利用RT-qPCR检测miR-199a-5p在乳腺癌细胞(MCF-7细胞)和人正常乳腺上皮细胞(MCF-10A细胞)中的差异表达。过表达或下调miR-199a-5p表达,通过MTT试剂盒检测MCF-7细胞增殖能力,Transwell检测MCF-7细胞的侵袭能力,Western blot检测过表达及下调miR-199a-5p对MCF-7细胞EMT的影响。TargetScan分析miR-199a-5p的作用靶点,双荧光素酶报告基因实验检测miR-199a-5p和HIF1α之间的关系。RT-qPCR检测HIF1α在MCF-7细胞和MCF-10A细胞中的差异表达。HIF1α siRNA质粒转染细胞后,检测下调HIF1α对MCF-7细胞增殖、侵袭和EMT的影响。过表达HIF1α后,Western blot检测细胞内JAK、p-JAK、STAT3和p-STAT3蛋白的表达量。将AG490作用MCF-7细胞后再转染pcDNA-HIF1α质粒,检测MCF-7细胞增殖、侵袭和EMT能力。结果:与MCF-10A细胞相比,MCF-7细胞中miR-199a-5p表达明显降低(P<0.01),HIF1α表达明显上升(P<0.01)。过表达miR-199a-5p抑制了MCF-7细胞增殖、侵袭与EMT,下调miR-199a-5p促进了MCF-7细胞的增殖、侵袭与EMT;miR-199a-5p靶向HIF1α,且负调控HIF1α表达;siRNA下调HIF1α表达后明显抑制了MCF-7细胞增殖、侵袭和EMT;上调HIF1α表达后,激活MCF-7细胞内JAK/STAT3通路,AG490作用MCF-7细胞能明显抑制HIF1α对MCF-7细胞增殖、侵袭和EMT的促进作用。结论:下调miRNA-199a-5p靶向HIF1α激活JAK/STAT3通路促进乳腺癌细胞增殖与恶性转移。

猪miR-199a-5p对脂质生成的影响及其靶基因的预测和分析

本研究旨在分析miR-199a-5p对猪肌内脂肪细胞脂质生成的影响及作用机制。采集淮南猪不同育肥时期(育肥前期、中期和后期)的背最长肌和皮下脂肪组织,通过实时荧光定量PCR分析其表达变化趋势;合成miR-199a-5p的mimics,转染猪原代肌内脂肪细胞,诱导分化后通过油红O染色观察过表达miR-199a-5p对脂质生成的影响;结合之前筛选到的脂肪型和瘦肉型猪差异表达mRNAs、lncRNAs和circRNAs,使用miRanda软件筛选miR-199a-5p的靶分子,并用GO和KEGG富集分析法对这些mRNAs、lncRNAs的共表达基因和circRNAs的来源基因进行功能分析。结果显示,随着育肥进程,miR-199a-5p在背最长肌中表达量持续上调,而在皮下脂肪组织中表达量先下调后上调;过表达miR-199a-5p可抑制肌内脂肪细胞的脂质生成。共筛选到9个mRNAs、5个lncRNAs和1258个circRNAs包含miR-199a-5p结合位点,GO分析主要富集于内质网和肌动蛋白结合,KEGG分析发现主要富集于糖、脂质和蛋白质代谢。提示miR-199a-5p可能通过与lncRNAs和circRNAs互作间接调控靶基因,参与调控肌肉发育、脂质生成和代谢,可作为影响肉质性状的候选miRNA。

miR-223、miR-200b、miR-199a-5p在缺血性脑卒中患者中的表达及相关性研究

目的 探讨微小RNA(miR)-223、miR-200b、miR-199a-5p在缺血性脑卒中(IS)患者中的表达及相关性。方法 选取2019年3月—2021年3月上海市第六人民医院金山分院IS患者132例为研究对象,根据90 d后改良Rankin量表(mRS)评分分为预后不良组(n=51,mRS评分>2分)和预后良好组(n=81,mRS评分≤2分)。比较两组基线资料,美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)、mRS评分,血清miR-223、miR-200b、miR-199a-5p,分析上述血清指标与NIHSS、mRS评分的相关性,探讨IS预后不良的影响因素,评价上述血清指标对IS预后的预测价值及不同表达与IS预后的关系。结果 预后不良组血清miR-223、miR-199a-5p表达高于预后良好组,血清miR-200b表达低于预后良好组(P<0.05);miR-223、miR-199a-5p与NIHSS、mRS评分呈正相关,miR-200b与NIHSS、mRS评分呈负相关(P<0.05);将卒中分型、NIHSS评分、血小板计数、发病至治疗时间等其他因素控制后,血清miR-223、miR-200b、miR-199a-5p与IS预后不良(mRS评分)显著相关(P<0.05);血清miR-223、miR-200b、miR-199a-5p联合预测IS预后不良的曲线下面积(AUC)最大,为0.928;miR-223、miR-199a-5p高表达者预后不良发生率高于低表达者,miR-200b低表达者预后不良发生率高于高表达者(P<0.05)。结论 血清miR-223、miR-199a-5p过表达和miR-200b表达缺失均与IS患者神经功能缺损程度及神经功能恶化有关,可为患者预后预测提供参考依据。

miRNA-199a-5p对骨肉瘤细胞增殖及自噬的影响

目的探讨mi RNA-199a-5p对人骨肉瘤细胞株U2OS增殖及自噬的影响及其可能的作用机制。方法实时定量PCR法检测32例骨肉瘤患者的病理组织标本及配对癌旁正常组织中mi RNA-199a-5p的表达水平。将mi RNA-199a-5p mimics转染入U2OS细胞,使其过表达mi RNA-199a-5p,采用CCK-8法和流式细胞仪检测细胞增殖及周期的变化;Western blot检测周期相关蛋白(cyclin D1、P27、p Rb)及自噬相关蛋白(Beclin 1、LC3Ⅱ/Ⅰ)表达水平。结果 mi RNA-199a-5p在骨肉瘤组织及癌细胞U2OS中低表达,且表达水平与肿块大小、远距转移、Enneking临床分期及病理分级密切相关。过表达mi RNA-199a-5p后,U2OS细胞的增殖能力显著降低(P<0.05),同时cyclin D1、p Rb表达水平显著下降,而P27、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1的表达水平显著增加(P<0.05)。结论 mi RNA-199a-5p能够抑制人骨肉瘤细胞株U2OS的增殖并激活细胞自噬;其作用机制可能与下调cyclin D1、上调P27、抑制p Rb蛋白的磷酸化、造成细胞周期G1/S阻滞有关。提示mi RNA-199a-5p可以作为骨肉瘤临床治疗的潜在作用位点。