猪CD1d蛋白多克隆抗体的制备及应用

[目的]制备猪源CD1d的多克隆抗体,为探究猪CD1d蛋白在非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染过程中的功能奠定基础。[方法]利用PCR方法扩增了猪CD1d基因,并将其同源重组至pGEX-6p1载体中,构建了原核重组表达质粒pGEX-6p1-CD1d。将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)并用IPTG进行诱导表达,表达的GST-CD1d重组蛋白经SDS-PAGE和Western blot(WB)方法鉴定,SDS-PAGE结果显示约50 ku处有一条明显的条带,该蛋白以包涵体形式表达。然后利用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析方法进行蛋白纯化,将纯化的GST-CD1d蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化后,将纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,采用颈背部多点皮下注射,免疫剂量为200μg/只,首免后第3周和第5周分别进行二免和三免,均采用弗氏不完全佐剂乳化,方法和剂量与首免相同。三免后第7天,通过耳缘静脉采血分离血清。首免后第7周进行第四次免疫,一周后心脏采血。该抗体经Protein G亲和层析纯化后冻存于-80℃冰箱。通过WB和间接免疫荧光(IFA)鉴定瞬时转染表达的外源CD1d蛋白和猪原代巨噬细胞(PAMs)表达的内源CD1d蛋白的表达与细胞定位情况。同样,制备的CD1d抗体可以将外源瞬时转染表达的CD1d通过IP拉下。为了探究CD1d在ASFV感染早期的情况,将ASFV接种于PAMs,制备ASFV感染0、15、30、60 min的样品,以CD1d为一抗,通过WB检测了CD1d蛋白的表达情况。在HEK293T细胞共转pCAGGS-HA-CD1d和pCAGGS-Flag-CD2v质粒,24 h后收取细胞裂解,加入Flag beads过夜结合蛋白,通过WB检测互作情况染,同时,质粒共转染于共聚焦小皿中的HEK293T细胞,用标签抗体对其进行孵育,选择相应的荧光二抗,通过激光共聚焦显微镜观察CD1d与CD2v在细胞中共定位情况。采用Co-IP验证CD1d与ASFV外囊膜蛋白CD2v的相互作用。[结果]原核表达的GST-CD1d蛋白以包涵体形式表达在感受态细胞中,分子质量约为35 ku;实验兔4次免疫CD1d重组蛋白后采血并分离血清,纯化的抗体经SDS-PAGE检测在45和25 ku处各出现一条特异性条带,分别为CD1d抗体的重链与轻链。以纯化的CD1d蛋白作为免疫原制备的兔抗CD1d抗体包含重链和轻链,且具有较好纯度;该抗体能够通过WB和IFA鉴定瞬时转染的外源以及PAMs内源CD1d蛋白的表达和细胞定位。进一步检测结果显示,ASFV感染PAMs后,CD1d蛋白表达水平明显增加,并且WB和IFA结果显示CD1d与ASFV编码的外囊膜蛋白CD2v存在相互作用和共定位。[结论]通过原核表达技术制备了CD1d的抗体,为进一步探究CD1d蛋白在ASFV感染过程中的生物学功能打下了基础。

猪流行性腹泻病毒S1D蛋白的优化表达及其单克隆抗体的制备

为进一步探究猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S蛋白的抗原表位及其功能,本试验通过优化S1D基因的密码子,构建了S1D基因未优化的重组原核表达质粒pET-S1D和已优化的pET-ΔS1D,并进行了诱导表达和纯化。使用SDS-PAGE和Western blotting方法验证S1D、ΔS1D蛋白在大肠杆菌内得到正确表达,利用Image J软件对S1D、ΔS1D蛋白表达量进行灰度扫描,通过t检验分析两者差异性。将纯化的ΔS1D蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合、筛选及亚克隆,获得单克隆细胞株。利用体内诱生法制备抗PEDV S1D蛋白的单克隆抗体腹水,使用ELISA、Western blotting、间接免疫荧光试验3种方法对腹水效价及特异性进行检测和验证。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,表达S1D、ΔS1D蛋白的样品均在34 ku处出现正确的目的条带。t检验结果表明,S1D、ΔS1D两者蛋白表达量差异极显著(P<0.01)。ELISA结果显示,腹水的抗体效价达到了1∶1000000,腹水与PEDV病毒粒子和纯化后的ΔS1D蛋白反应均呈阳性,与PEDV N蛋白、pET-32a(+)空载体蛋白和猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)5种病毒反应均呈阴性。Western blotting结果显示,腹水与ΔS1D蛋白和PEDV S蛋白分别在34和180 ku处有特异性条带出现,与pET-32a(+)空载体蛋白、正常Vero细胞蛋白均无特异性条带出现。间接免疫荧光试验结果显示,腹水及阳性对照组均能使细胞出现特异性绿色荧光信号,而空白及阴性对照组均未见绿色荧光信号。密码子优化可在原核表达系统中显著提高重组蛋白的表达水平,本研究基于高效表达的ΔS1D蛋白,成功制备了1株能稳定分泌与PEDV S蛋白特异性结合的单克隆抗体的细胞株,为进一步探究PEDV S蛋白抗原表位及蛋白功能的研究奠定了基础。

A型口蹄疫病毒1D蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达、纯化及电子显微镜检测

目的本实验旨在表达出高可溶性的A型口蹄疫病毒1D蛋白,并通过电子显微镜检测,以期望形成纳米样颗粒。方法根据A型口蹄疫病毒核酸序列,得到FMDV A/GDMM/CHA/2013株的1D蛋白基因,并进行截短和优化,共132个氨基酸;同时,从结肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)中分离得到135个氨基酸的铁蛋白(Fn)基因片段,将A型口蹄疫病毒1D蛋白与铁蛋白串联,设计并合成了口蹄疫病毒1D蛋白-铁蛋白片段,命名为CcFnt166AS。构建了CcFnt166AS融合Grifin、GST、MBP、Sumo、Thioredoxin、γ-crystallin、ArsC、PpiB、CeHSP17等9种不同可溶性标签的表达重组载体。分别转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,SDSPAGE电泳对融合蛋白的可溶性表达进行检测,筛选出高可溶性表达的CcFnt166AS融合蛋白。重组蛋白通过NiNTA Agarose亲和纯化,进行电子显微镜检测。结果成功构建9种CcFnt166AS表达载体;9个标签中,MBP与CcFnt166AS蛋白相融合的可溶表达效果最好,并获得了高纯度的MBP-CcFnt166AS重组蛋白质;电子显微镜结果显示,MBP-CcFnt166AS形成了纳米样颗粒。结论本实验建立了稳定获得CcFnt166AS重组蛋白质的方法。

肝片吸虫CatL1D蛋白的免疫原性研究

【目的】研究绵羊肝片吸虫(Fasciola hepatica,Fh)CatL1D蛋白的分子特征和免疫原性。【方法】利用RT-PCR技术扩增出CatL1D基因,用相关软件分析其编码蛋白的生物学信息。将CatL1D基因克隆入表达载体pET-32a(+)中,构建原核表达载体pET-CatL1D,进行BamHⅠ/XhoⅠ双酶切和测序鉴定。将pET-CatL1D载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE和Western blot分析;以纯化后的重组蛋白CatL1D为抗原免疫小鼠,利用间接ELISA方法检测抗体效价,分析其免疫原性。【结果】成功克隆了CatL1D基因,该基因全长981 bp,编码326个氨基酸,其中第21-79位氨基酸为组织蛋白酶前肽抑制剂结构域,第108-321位氨基酸为木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶保守结构域;CatL1D蛋白含有6个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、11个豆蔻酰化位点、1个蛋白激酶C磷酸化位点,含有10个优势抗原表位。成功构建了pET-CatL1D原核表达载体,诱导表达出CatL1D重组蛋白;SDS-PAGE和Western blot分析表明,重组蛋白CatL1D分子质量为51 ku,以包涵体的形式表达,具有较强的反应原性。间接ELISA法检测结果表明,重组蛋白CatL1D免疫小鼠血清抗体效价可达1∶102 400,证实其具有良好的免疫原性。【结论】Fh重组蛋白CatL1D具有较强的抗原性,有开发为早期诊断抗原和亚单位疫苗的潜力。

Bcl-3、cyclin D1、P53、Ki-67蛋白在乳腺导管内增生性病变的表达及其意义

目的探讨B细胞淋巴瘤因子3(Bcl-3)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、P53基因编码蛋白和增殖细胞核蛋白(Ki-67)在乳腺导管内增生性病变中的表达及应用价值。方法采用免疫组化检测乳腺普通型导管增生(UDH)、柱状上皮病变(CCL)、非典型导管增生(ADH)和导管原位癌(DCIS)组织中Bcl-3、cyclin D1、P53和Ki-67蛋白的表达。结果Bcl-3、cyclin D1、P53、Ki-67蛋白在UDH中均少量表达;在CCL、ADH和DCIS中均明显表达,且随着病变的级别升高,阳性率逐渐增高(P<0.05);Bcl-3、cyclin D1、P53和Ki-67蛋白在CCL、ADH和DCIS中着色强阳性(++~+++)的表达,差异有统计学意义(P<0.05)。结论Bcl-3、cyclin D1、P53和Ki-67蛋白的表达在乳腺导管内增生性病变的病理诊断、鉴别诊断及指导临床治疗方面有较高应用价值,可显著提高乳腺导管内增生性病变的诊断准确率。

人乳头瘤病毒16/18感染与膀胱癌组织cyclinD1、P53蛋白表达的相关性分析

目的 分析人乳头瘤病毒(HPV)16/18感染与膀胱癌组织细胞周期蛋白D1(cyclinD1)、P53蛋白表达的相关性。方法 采集62例膀胱癌患者的癌组织和癌旁组织。采用免疫组化染色和半定量积分方法,检测HPV16/18、cyclinD1和P53蛋白在膀胱癌及癌旁组织中的表达水平,并分析其表达与膀胱癌临床病理特征的关系以及THPV16/18与cyclinD1、P53蛋白表达的相关性。结果 膀胱癌组织中,HPV16/18、cyclinD1和P53蛋白的阳性率高于癌旁组织(P<0.05);HPV16/18、cyclinD1和P53蛋白阳性率病理分级高、临床分级高、有远处转移的膀胱癌组织分别高于病理分级低、临床分级低、无远处转移的膀胱癌组织(P<0.05);HPV16/18阳性组cyclinD1和P53蛋白阳性率高于HPV16/18阴性组(P<0.05);膀胱癌组织中HPV16/18表达与cyclinD1表达无相关性(P>0.05),与P53蛋白表达呈正相关(P<0.05)。结论 HPV16/18、cyclinD1和P53蛋白均参与了膀胱癌的发生和发展,HPV16/18可以影响P53蛋白的表达,参与膀胱癌的进展。

CyclinD1联合CA72-4、胃蛋白酶原、CEA检测在胃癌诊断中的价值

目的研究细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)联合糖链抗原72-4(CA72-4)、胃蛋白酶原(PG)、癌胚抗原(CEA)检测在胃癌诊断中的价值。方法选取我院2021年10月~2023年3月内镜中心常规行内镜检查的疑似胃癌患者90例为研究对象,根据组织病理学检查结果将其分为良性胃疾病组(n=54)及胃癌组(n=36),入选患者均接受Cyclin D1、CA72-4、PG、CEA检测,比较各组上述指标表达水平,分析各项指标与胃癌病理分期的相关性,并绘制ROC曲线评价各指标对胃癌的诊断价值。结果胃癌组CEA、CA72-4、PGⅡ水平,Cyclin D1阳性率均高于良性胃疾病组,PGⅠ水平低于良性胃疾病组(P<0.05);TNM分期Ⅰ~Ⅳ期患者CEA、CA72-4、PGⅡ水平,Cyclin D1阳性率逐渐升高,PGⅠ水平逐渐降低(P<0.05);CEA、CA72-4、PGⅡ水平,Cyclin D1阳性率与病理分期呈正相关,PGⅠ水平与病理分期呈负相关(P<0.05);绘制ROC曲线发现,5项指标单独检测对胃癌均具有诊断价值,但相较而言,联合检测诊断胃癌的AUC更高,为0.906,约登指数为0.713,且敏感性、特异性均在85.00%以上。结论Cyclin D1联合CA72-4、PGⅠ、PGⅡ、CEA检测对胃癌诊断的敏感性较高,具有良好的诊断价值。

盐胁迫下桑树叶片D1蛋白周转和叶黄素循环对PSⅡ的影响

采用抑制剂法研究盐胁迫下D1蛋白周转和叶黄素循环对桑树叶片PSⅡ功能的影响。结果表明:桑树叶片在100mmol·L-1NaCl胁迫下保持较高的PSⅡ反应中心的活性,具有完善的光破坏防御机制。通过硫酸链霉素(SM)抑制D1蛋白的周转和二硫苏糖醇(DTT)抑制叶黄素循环,损伤盐胁迫下桑树叶片的PSⅡ反应中心,加剧盐胁迫对桑树叶片PSⅡ反应中心的伤害,说明D1蛋白周转和叶黄素循环在保护盐胁迫下桑树叶片PSⅡ功能中发挥重要的作用,并且D1蛋白周转的保护作用大于叶黄素循环。DTT抑制盐胁迫下桑树叶片的叶黄素循环,却将PSⅡ反应中心吸收的光能大部分以无效的荧光和热能形式耗散,减缓过剩激发能对PSⅡ反应中心的伤害程度。SM处理可抑制D1蛋白周转,减弱盐胁迫下桑树叶片以叶黄素循环为主的耗散非辐射能量的能力,降低过剩激发能的热耗散程度,导致叶片中的过剩光能(1-qP)/NPQ成倍积累,造成PSⅡ反应中心大量失活。因此,SM不但可抑制D1蛋白的周转,还可增强QB的还原程度,降低电子传递链上的电子传递,PQ库容量降低,减弱依赖PQ在类囊体膜两侧建立质子梯度(△pH)的能力,从而限制依赖于△pH的叶黄素循环。因此,盐胁迫下抑制D1蛋白的周转不但降低吸收光能后用于电子传递的比例,而且会破坏叶黄素循环耗散过剩的光能,这也是D1蛋白周转对PSⅡ的保护作用大于叶黄素循环的原因之一。

高温胁迫对水稻光合PSII系统伤害及其与叶绿体D1蛋白间关系

以水稻结实期的人工控温试验测定不同温度处理下水稻旗叶光合速率、叶绿素荧光参数的动态变化,并结合Western印迹与胶体金标记技术对叶肉细胞类囊体膜中D1蛋白的表达检测与活性定位,探讨了高温胁迫对D1蛋白存在形态与活性分布的影响,以及D1蛋白表达与叶片光合速率、PSII荧光参数的联系。结果表明,高温处理下叶片净光合速率下降、PSII潜在活性(Fv/Fo)和PSII光能转化效率(Fv/Fm)降低,且随着高温胁迫时间的持续和叶片功能的衰退,类囊体膜结构损伤越严重,光能转化效率越低;在D1蛋白的两类存在形态中,非磷酸化D1蛋白和磷酸化D1蛋白在高温胁迫下的表达量均有所下降,但前者下降更明显;高温处理下控制D1蛋白表达的叶绿体psbA基因在转录水平呈下调表达,使D1蛋白合成及周转过程受到抑制,进而类囊体膜PSII反应中心的功能受损与叶绿体光合效率下降,揭示高温胁迫对叶片PSII系统的伤害受D1蛋白磷酸化过程和psbA基因表达变化的共同作用,进而影响不同水稻品种在高温胁迫下的光合速率和耐热性。

白粉病菌侵染对黄瓜叶片光合电子传递及其PSⅡ功能蛋白D1表达的影响

本文研究了黄瓜(Cucumis sativus L.)感染黄瓜白粉病后,植物叶绿素含量、光合电子传递速率和光化学反应中心D1蛋白的变化。被感染的黄瓜叶片叶绿素含量降低,而且Chlb比Chla敏感。全链电子传递速率受到抑制,PSⅡ电子传递速率的变化与全链电子传递速率的变化趋势相似,但PSⅠ电子传递速率却未受到抑制。由于PSⅡ的光合反应中心D1蛋白含量变化与PSⅡ电子传递速率的变化类似,推测D1蛋白的表达量变化是引起电子传递活性波动的主要因素。

高温强光胁迫对砂梨叶片光合作用、D1蛋白和Deg1蛋白酶的影响

【目的】研究夏季高温强光下砂梨叶片光合特征的变化,探讨梨光抑制的分子机制。【方法】以1年生‘翠冠’和‘圆黄’梨的盆栽苗为试验材料,测定了夏季晴天高温强光对气体交换参数和光响应曲线的影响,以及D1蛋白、Deg1蛋白酶含量和PsbA mRNA表达的变化。【结果】‘翠冠’和‘圆黄’梨叶片在夏季晴天中午高温强光的双重胁迫下,净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)、表观量子效率(AQY)、D1蛋白和Deg1蛋白酶含量显著下降,而PsbA mRNA积累增加。到了17:00,‘翠冠’的D1蛋白、Deg1蛋白酶含量得到恢复,Pn略有回升,而‘圆黄’未出现明显的恢复迹象。【结论】高温强光下2个梨品种的叶片均发生了光抑制,低含量的Deg1不是降解D1蛋白的主要蛋白酶。高温强光诱导的D1蛋白净含量的减少主要是由于D1蛋白合成在翻译阶段受到了抑制。从下午的光合和D1蛋白的恢复来看,‘翠冠’梨的PSII比‘圆黄’梨更抗高温。

条锈病对小麦(Triticum aestivum L.)叶片光合功能及光合功能蛋白D1表达的影响

测定了小麦(Triticum aestivum L.)感染小麦条锈病后的光合常数,以及叶绿素含量、类囊体膜光合电子传递速率和光合反应中心D1蛋白的变化。实验显示,条锈病侵染导致感病小麦叶片净光合速率与叶绿素含量降低;抗病小麦经侵染后净光合速率却有恢复过程,叶绿素含量先降后升。此外,感病小麦叶片被侵染后全链电子传递速率受到抑制,PSII电子传递速率的变化与全链电子传递速率的变化趋势相似,但PSI电子传递速率受到的影响较小;抗病小麦小麦叶片被侵染后电子传递速率所受影响较小。同时发现,病程中,感病和抗病小麦PSII的光合反应中心D1蛋白含量变化总是与PSII电子传递速率的变化类似,推测D1蛋白的表达量变化是引起PSII电子传递活性与全链电子传递速率变化的主要因素之一。

干旱胁迫下外源油菜素内酯对玉米幼苗光合作用和D1蛋白的调控效应

为了揭示干旱胁迫下外源油菜素内酯对玉米幼苗光合作用的保护机制,采用溶液培养的方法,以驻玉309为试验材料,研究外源油菜素内酯(BR)预处理及20% PEG-6000模拟干旱胁迫后玉米幼苗的生长参数、叶绿素含量、光合参数、叶绿素荧光参数及D1蛋白含量的变化。结果表明,与干旱胁迫处理(PEG)相比,BR+PEG处理的玉米苗株高增加45.87%,根长增加20.56%,总干物质积累增加8.01%,叶片相对含水量提高4.50%,叶绿素a含量增加26.32%,光合参数(Pn、Gs、Ci、Tr)分别提高9.57%,38.23%,30.19%,28.12%,光合系统Ⅱ(ΦPSⅡ)活性提高了20.48%,最大光化学效率提高了0.66%,光合系统Ⅱ绝对电子传递速率(ETR(Ⅱ)和相对电子传递速率r ETR(Ⅱ))分别提高20.40%和31.02%;D1蛋白含量增加37.34%(P<0.05)。说明在干旱胁迫条件下叶片喷施BR可以改善玉米幼苗的生长发育,减缓光合系统的损伤,促进D1蛋白质的稳定,从而提高玉米幼苗对干旱胁迫的适应性。

D1蛋白周转和叶黄素循环在青花菜叶片强光破坏防御中的作用

【目的】明确青花菜叶片的光抑制特性和主要光破坏防御机制,为青花菜高产高效栽培和选育光破坏防御能力强的品种提供理论依据。【方法】应用抑制剂法和叶绿素荧光测定技术,研究D1蛋白周转和叶黄素循环在青花菜叶片强光破坏防御中的作用。【结果】1800μmol·m-2·s-1强光下胁迫1～4h,或夏季晴天中午强光高温下,青花菜叶片的最大光能转化效率Fv/Fm降低,初始荧光Fo升高;暗中恢复5h或下午光强减弱后,Fv/Fm和Fo均可恢复。硫酸链霉素(SM)或二硫苏糖醇(DTT)处理使强光下青花菜叶片的Fv/Fm、光化学猝灭系数(qP)、开放的PSⅡ有效光能转化效率(F’v/F’m)和实际光化学效率(ΦPSⅡ)的下降幅度增大,SM处理的下降幅度大于DTT处理。强光处理4h后再暗恢复12h的青花菜叶片在1000μmol·m-2·s-1光强下进行荧光诱导,诱导结束时SM处理的ΦPSⅡ和F’v/F’m分别较CK降低85.71%和80.31%,DTT处理的分别较CK降低22.45%和11.48%。【结论】青花菜叶片具有完善的光破坏防御机制,抑制D1蛋白周转和叶黄素循环,均可使强光下青花菜叶片的PSⅡ反应中心遭受破坏,抑制D1蛋白周转的破坏程度大于抑制叶黄素循环;D1蛋白周转在青花菜叶片光破坏防御中的作用大于叶黄素循环。

鼻咽癌细胞中EB病毒编码的潜伏膜蛋白1活化cyclinD1的表达

为了探讨EB病毒编码的潜伏膜蛋白 1(EBV LMP1)促进细胞增殖 ,参与EBV相关疾病致瘤的分子机制 ,研究了LMP1在鼻咽癌细胞中调节cyclinD1表达 ,进而影响细胞周期行进及细胞恶性表型改变 ,并初步确定了LMP1发挥该功能的结构域 .利用已建株的Tet on LMP1 HNE2鼻咽癌细胞系 ,蛋白质印迹实验分析LMP1诱导cyclinD1蛋白质表达的表达动力学 ,包括时间效应及剂量效应 ;利用三种LMP1功能区缺失的突变体及野生型LMP1,以载体型细胞为对照 ,确定LMP1活化cyclinD1表达的结构域 .同时结合基因诱导表达及反义寡聚核酸技术阻断基因表达的实验方法 ,进一步确定LMP1上调的cyclinD1功能 ,即对细胞周期行进及细胞恶性表型的影响 .结果表明LMP1确实可以诱导cyclinD1的表达 (2～ 4倍 ) ,且诱导具有时间依赖性及剂量依赖性 ;利用三种LMP1功能区缺失的突变体及野生型LMP1,以载体型细胞为对照 ,结合报道基因分析法 ,确定与空白载体细胞系比较 ,野生型LMP1从转录水平可反式激活cyclinD1报道基因活性约 11 2倍 ,其中CTAR1及CTAR2均可活化cyclinD1表达 ,但以CTAR2为主 ,与野生型LMP1诱导cyclinD1反式激活活性比较 ,CTAR1缺失导致cyclinD1报道基因活性下降 2 3 6 % ,CTAR2缺失导致cyclinD1活性下降约 80 7% ,C端均缺失时cyclinD1活性只?

Deg2蛋白酶在拟南芥光损伤D1降解及光保护中的作用

已有研究表明叶绿体内有200种蛋白酶,然而,多数蛋白酶的作用机制尚不清楚,尤其哪些蛋白酶参与了D1蛋白周转。其中Deg2蛋白酶体外实验证明,其参与了光损伤D1蛋白的的初步剪切。为了进一步研究Deg2蛋白酶在植物体内的作用机制,我们筛选了拟南芥Deg2蛋白酶功能缺陷型突变体。在120μmol·m-·2s-1光照生长条件下,deg2突变体与野生型的生长曲线基本一致;在进一步的高光胁迫(1800μmol·m-·2s-1)处理及相同的光胁迫处理条件下,无论林可霉素存在与否,突变体PSⅡ的最大光化学效率(Fv/Fm)都和野生型没有区别;利用蛋白免疫印迹实验同样证明了光损伤D1蛋白的降解速度在deg2突变体和野生型之间也没有明显区别。我们认为Deg2蛋白酶在光抑制情况下对于光损伤D1蛋白的降解以及PSⅡ的修复不是必需的。

高温强光对温州蜜柑叶绿素荧光、D1蛋白和Deg1蛋白酶的影响及SA效应

以3年生温州蜜柑(Citrus unishiuMarc.)植株为试材,用叶绿素荧光分析、Western-blotting蛋白质印记技术及DAB(3,3′-二氨基联苯胺)显色法,研究了高温强光(38℃和1600μmo.lm-.2s-1)对叶片叶绿素荧光参数、PS(光系统)Ⅱ反应中心D1蛋白和Deg1蛋白酶的影响和SA(水杨酸)的效应。结果表明,高温强光交互作用4 h后,叶片的初始荧光Fo升高,最大光能转化效率Fv/Fm、表观光合电子传递速率ETR及PSⅡ的量子产额ΦPSⅡ显著降低;在D1蛋白降解的同时,Deg1蛋白酶含量也下降,并伴有H2O2的积累。在高温强光下,外源的H2O2使叶绿素荧光动力学快相参数(Fi-Fo)/(Fp-Fo)值(反映PSⅡ中QB非还原中心的数量)升高和I-P的斜率(反映PSⅡ活化中心还原态QA积累的值)下降,Fv/Fm、ETR、ΦPSⅡ及D1蛋白和Deg1蛋白酶下降幅度增大;而外源的SA使这些参数下降幅度减小。这些结果说明,高温强光诱导H2O2的积累造成Deg1蛋白酶和光系统反应中心D1蛋白的降解,Deg1蛋白酶的减少也进一步限制了D1蛋白的周转,进而使温州蜜柑PSⅡ反应中心遭到破坏,SA对光合机构光破坏有保护作用。

光温交互作用对柑橘植株叶绿素荧光和D1蛋白的影响

利用叶绿素荧光分析、SDS-PAGE电泳和Western-blotting蛋白质印迹技术,研究高光高温交互作用(30℃和1300μmol?m-2?s-1)对3年生温州蜜柑叶片叶绿素荧光特性和D1蛋白水平的影响.试验结果表明,在高温高光条件下生长50 d后,温州蜜柑叶片的总叶绿素、叶绿素a含量及叶绿素a/b值均显著下降,而叶绿素b的含量变化不显著.叶片叶绿素荧光参数的初始荧光Fo升高,而反映光化学效率的Fv/Fm值、光化学猝灭系数qP及光系统Ⅱ(PSⅡ)电子传递能力ΦPSⅡ下降,同时反映热耗散的非光化学猝灭系数qN上升.表观电子传递(ETR)光响应的"光饱和点"和低于200μmol?m-2?s-1光强下的斜率降低.在荧光动力学快相中,反映QA还原活性的(Fi-Fo)/(Fp-Fo)值下降,反映失活的PSⅡ反应中心比例的Fi到Fp的斜率显著增加.此外,PSⅡ反应中心D1蛋白的合成速率小于降解速率,导致D1蛋白的净降解.这些结果说明,高温高光抑制了D1蛋白的修复,致使PSⅡ反应中心失活,电子传递和光化学效率下降.

田间小麦叶片光合作用的光抑制不伴随D1蛋白的净降解

通过测定田间小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ ）叶片Ｄ１蛋白的含量、光合放氧和叶绿素ａ 荧光，探讨了叶片光合作用的光抑制与Ｄ１蛋白净降解的关系。田间的小麦叶片受到晴天中午光照约３ ｈ 以后，表观光合量子效率（Φ）、光系统Ⅱ的光化学效率（Ｆｖ／Ｆｍ ）和初始荧光（Ｆ０）明显下降；若将叶片转入弱光下，这３个指标可在１ ｈ 内基本恢复；强光照射过程中Ｄ１蛋白的含量没有显著变化；Ｄ１蛋白合成抑制剂ＳＭ 使强光下叶片的慢驰豫的非光化学荧光猝灭（ｑＥ－ｓｌｏｗ ）明显增加；在弱光下恢复时引入链霉素（ＳＭ）不影响叶片光合功能的恢复；用二硫苏糖醇（ＤＴＴ）抑制叶黄素循环使中午强光照射后的叶片中Ｄ１蛋白的含量降低３０％ 左右。这些结果都表明，田间小麦叶片光合作用的光抑制不是由于Ｄ１蛋白的净降解，而是由于非辐射能量耗散的增加引起的。

种植密度和方式对夏玉米叶绿体D1蛋白和PSII功能的影响

在豫北高产灌溉区生产条件下,以＂浚单20＂、＂郑单958＂玉米为试验材料,研究不同种植密度和种植方式下两种夏玉米生理指标和产量的变化。结果表明：密度在6.75万~9.00万株·hm-2范围内,随着种植密度的增加,玉米穗位叶D1蛋白含量、可变荧光与最大荧光比（Fv/Fm）、光化学淬灭系数（qP）、光合速率（Pn）、SOD活性和单株产量降低,非光化学淬灭系数（NPQ）、POD活性、MDA含量、秃尖长增加,单位面积产量呈先增加后降低的趋势。密度≥8.25万株·hm-2时,Fv/Fm、qP、Pn、叶片SOD活性急剧降低,密度9.00万株·hm-2比8.25万株·hm-2降低1.2%~21.7%;NPQ、MDA含量、POD活性急剧升高,密度9.00万株·hm-2比8.25万株·hm-2升高3.2%~15.0%。Fv/Fm、qP、Pn、SOD活性宽窄行种植模式高于等行距模式,NPQ、MDA含量、POD活性宽窄行种植模式低于等行距模式。密度≥7.50万株·hm-2后,＂郑单958＂的Fv/Fm、qP、Pn、SOD活性高于＂浚单20＂,NPQ、MDA含量、POD活性低于＂浚单20＂。品种、种植方式和密度三因素对D1蛋白含量,Fv/Fm、qP、Pn、NPQ,SOD、POD活性,MDA含量及产量影响差异显著,且三因素互作的影响也差异显著。两种玉米的最适种植方式为密度不高于8.25万株·hm-2且宽窄行种植。