首批1型单纯疱疹病毒溶瘤活性测定国家候选标准品的研制

目的:研制首批1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus 1,HSV-1)溶瘤活性测定国家标准品。方法:按2020年版《中华人民共和国药典》三部相关要求,分别进行HSV-1溶瘤活性测定液体标准品和冻干标准品的制备和质量检测,并使用热加速试验进行稳定性考察,以U-2 OS细胞/CCK-8法分别在3家实验室对标准品的溶瘤活性进行协作标定。对比研究液体标准品和冻干标准品,选择其中更为适用的1种作为国家标准品。结果:制备的2种HSV-1溶瘤活性测定标准品的质量检测结果均符合要求,其中冻干标准品水分含量为1.09%,分装精度为0.15%。稳定性试验结果用阿伦尼乌斯公式计算,初步预测液体标准品溶瘤活性在-70℃下降低10%需7.7年;冻干标准品溶瘤活性在-70℃下降低10%需6.1×10^(5)年,其稳定性得到很大提高。3个实验室协作标定进行了共21次测定,液体标准品的溶瘤活性值几何均数为7.08×10^(4)U·mL^(-1),冻干标准品的溶瘤活性值几何均数为1.82×10^(4)U·支^(-1)。HSV-1标准品原液在冻干后溶瘤活性由7.08×10^(4)U·mL^(-1)下降至3.03×10^(4)U·mL^(-1),但因其溶瘤活性在预稀释100倍后仍然出现良好的S型量效关系曲线,并不影响它作为标准品使用的要求。将液体标准品作为样品,用冻干标准品作为标准品进行校准后,3家实验室结果的几何变异系数(GCV)由64.4%下降到29.2%,实验的精密度得到较大提高。结论:该批HSV-1溶瘤活性测定冻干标准品各项指标均符合相关要求,与液体标准品相比更适合作为国家标准品使用,其溶瘤活性赋值为1.82×10^(4)U·支^(-1)。

U-2 OS细胞/CCK-8法测定1型单纯疱疹病毒溶瘤活性

目的:建立U-2 OS细胞/CCK-8比色法,用于测定1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type 1,HSV-1)溶瘤活性。方法:选择3株对HSV-1敏感的的细胞株,在细胞培养板上以梯度浓度的HSV-1感染一定时间后,加入CCK-8进行显色,用酶标仪检测后采用四参数曲线法进行量效关系拟合。在选择出量效关系最好的细胞株基础上,对方法的各项实验条件进行优化,并采用活性测定标准品对结果进行校正分析。对建立的方法初步验证准确性和精密度,并用上述方法对3批样品的溶瘤活性进行检测。结果:优化后的实验采用U-2 OS细胞株,1∶4的样品系列稀释比例,5×10^4 PFU·mL^-1的样品系列稀释初始浓度,每孔2.5×10^4个细胞的铺板数量,72 h感染时间和4 h CCK-8试剂反应时间等条件进行样品测定,得到的四参数方程拟合的量效关系曲线R^2大于0.99,信噪比较高,初步验证结果显示该方法的回收率为113.4%,日间精密度分析的几何变异系数(GCV)为21.8%。3批测试样品的溶瘤活性分别为3.52×10^3、3.93×10^4和1.61×10^5 U·mL^-1。结论:建立的U-2 OS细胞/CCK-8法可用于以HSV-1为载体的基因治疗药物溶瘤活性测定。