基于环介导等温扩增快速检测转基因大豆SHZD32-1成分

转基因大豆SHZD32-1是由我国自主研发的耐除草剂抗性品系。为给该品系转基因生物安全监管提供技术支撑,本研究开发其转基因成分的快速便捷式检测方法,主要基于环介导等温扩增技术,设计并筛选该转化体最佳特异性LAMP引物组,优化扩增温度和时间,并分析灵敏度、特异性及稳定性,建立SHZD32-1的LAMP检测体系。结果显示:在62~64℃条件下反应40~60 min扩增效果最佳;灵敏度标准达到质量分数0.05%,高于普通PCR(0.1%);特异性和稳定性较高,检测结果同普通PCR扩增一致。转基因大豆SHZD32-1成分LAMP技术不需要特殊仪器,检测时间短,结果可视化,灵敏度、特异性和稳定性高,有望用于转基因耐草甘膦大豆SHZD32-1的现场快速检测。

樱桃小果病毒1 RT-LAMP检测方法的建立与应用

樱桃小果病毒1(LChV-1)已成为严重影响樱桃产量与质量的重要因素之一。本研究基于环介导的等温扩增技术建立LChV-1的快速检测体系。依据NCBI数据库中LChV-1外壳蛋白基因序列设计了3组特异性引物,经优化,筛选获得1组特异性引物。以感染LChV-1的甜樱桃叶片总RNA为模板,构建RT-LAMP检测体系为:6.0 mM Mg^(2+),0.2μM的外引物和1.2μM的内引物,在57℃条件下反应60 min。使用RT-LAMP方法对35个疑似樱桃小果病的甜樱桃样品进行检测,发现有13个样品感染了LChV-1,检测结果与RT-PCR法一致。RT-LAMP法具有特异性强、快速等特点,适合对LChV-1田间样品的快速检测与鉴定。

马疱疹病毒1型LAMP检测方法的建立

本试验旨在建立一种检测马疱疹病毒1型(EHV-1)的快速、灵敏、特异的环介导等温扩增技术(LAMP),同时评价该方法的可靠性。根据马鼻肺炎糖蛋白B(gB)基因特异保守序列设计多对LAMP引物,利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪监测反应进程,进行引物筛选和反应条件的优化,建立能特异性扩增EHV-1DNA的LAMP检测方法,并加入SYBR GreenⅠ通过肉眼判断结果。该方法在65℃恒温下作用50min,使EHV-1DNA获得了高效率的特异性扩增,与其他马易感病毒如马疱疹病毒4型(EHV-4)等无交叉反应;且具有极高的灵敏性,可检测到10-4稀释的目标病毒,比普通PCR的灵敏度高10倍;反应结束后加入SYBR GreenⅠ肉眼观察的结果与LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪监测结果一致。通过将4份临床样品的LAMP检测结果与已得到验证的PCR结果进行比对,结果显示符合率为100%。本研究建立的LAMP检测方法具有快速、特异、灵敏、简单易操作且设备要求低等特点,具有实地检测EHV-1的前景。

环介导等温扩增技术检测HIV-1 DNA

目的:建立环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法检测HIV-1 DNA。方法:首先从HIV-1数据库和基因库中下载不同亚型的HIV-1的LTR区序列,输入到MEGA 6.0软件中,用Cluster W程序进行比对与编辑,选择相对保守的区域并以FASTA格式输出。将FASTA格式文件上传至在线引物设计软件Lamp primer designing software primer explorer中,获得引物后再次与比对后的HIV序列进行比较,对保守性较差的位点使用简并碱基。用LAMP扩增试剂盒扩增时加入荧光目测试剂,观察反应管颜色变化,判断阴阳性结果。结果:本研究中设计的引物可用于LAMP技术检测HIV-1 DNA,具有较好的灵敏度和特异性。结论:成功地建立了LAMP技术检测HIV-1 DNA的方法,可用于HIV-1的早期诊断。

基于HDA的超级细菌耐药基因NDM-1检测方法的建立

本研究以建立解旋酶DNA恒温扩增(HDA)检测方法为目的,选择三种超级细菌NDM-1基因(metallo-beta-lactamase 1 gene)为目的基因,设计并合成特异性引物,建立和优化了可快速检测该种基因的HDA检测方法。特异性和灵敏度检测结果表明:该方法对NDM-1基因检测具有特异性,最低检测限可达10fg/μL,灵敏度高于普通PCR。提示HDA是一种针对NDM-1的快速、灵敏、便捷的非PCR核酸扩增技术。

NDM-1阳性细菌实时荧光LAMP方法的建立及应用

目的建立一种实时荧光环介导等温扩增(LAMP)方法快速检测新德里金属β-内酰胺酶1(NDM-1)阳性细菌。方法根据NDM-1基因序列设计4套引物并进行优化,对LAMP反应中的荧光染料SYTO-9浓度进行优化,同时考察该方法的检出限和特异性。利用本方法检测72例临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌。结果本研究建立的实时荧光LAMP方法,其荧光染料SYTO-9的最佳浓度为4μmol/L;63℃恒温扩增35 min可检出101拷贝/μL的标准阳性模板;特异性较好;对72例临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌检出的阳性率为16.7%(12/72),12株NDM-1阳性细菌经测序验证,准确率为100%。结论本研究建立的检测NDM-1阳性细菌的实时荧光LAMP方法具有快速、操作简便、特异性好、敏感性高、准确、可靠等优点,可以直观、实时地观察反应的进行情况,适合临床NDM-1阳性细菌的快速检测。

转基因番木瓜55-1品系的环介导等温扩增检测方法的建立

根据55-1的品系特异性序列设计了5套LAMP引物,筛选扩增效率高的引物。对筛选到的LAMP引物的反应温度和反应体系进行了优化,并进行了特异性、灵敏度和稳定性的实验。结果表明,该套LAMP引物的特异性和稳定性良好,灵敏度为0.05%,最快能在30 min内得到检测结果。建立的LAMP检测方法能有效地检测转基因番木瓜55-1品系,既简化了检测步骤,又缩短了检测时间,为转基因番木瓜的快速检测提供了技术支撑。

猪圆环病毒1型LAMP检测方法的建立及初步应用

为建立猪圆环病毒1型(PCV1)环介导等温扩增(LAMP)检测方法,为现场诊断提供技术支持,本试验根据GenBank公布的PCV1全基因组序列,在其保守区设计了4条特异性LAMP引物,并通过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验以及临床样本检测,首次建立了PCV1的LAMP检测方法。结果表明,62℃水浴60min为最佳反应条件;LAMP的检出限为1×10^(1)copies/μL,普通PCR最低检测限为1×10^(3)copies/μL;对猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)进行扩增,结果显示为阴性;应用该方法对103个临床疑似病料进行检测,阳性率为34.0%(35例),普通PCR阳性率为29.1%(30例),两种检测方法符合率为89.5%。本试验为PCV1临床检测提供了一种特异、快速、成本低廉的方法。

十足目虹彩病毒(DIV1)环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立及应用

本研究以十足目虹彩病毒(Decapod iridescent virus 1,DIV1)主要衣壳蛋白基因为靶序列设计引物,建立了DIV1的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并以pMD18-DIV1质粒标准品为模板对该方法的检测灵敏度、检测特异性等进行了评估。结果显示,此方法最适反应温度为64.4℃,优化后的25μl反应体系中包含2.5μl 10×Isothermal amplification buffer、4.0 mmol/L Mg^2+、1.2 mmol/L dNTPs、6.4 U Bst 2.0 WarmStart■DNA聚合酶、0.8μmol/L EvaGreen■和4.4μl ddH2O。该方法检测灵敏度下限为3.54×10^2拷贝/反应;与虾肝肠胞虫(EHP)、致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)、对虾偷死野田村病毒(CMNV)、传染性皮下及造血组织坏死病病毒(IHHNV)、白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉综合征病毒(TSV)和黄头病毒(YHV)等主要虾类病原没有交叉反应;具有较好的重复性和稳定性。以GeneFinder■替换EvaGreen■并将其预置于反应管内,结合上述扩增方法可实现对DIV1的现场快速高灵敏检测。本研究建立的DIV1-LAMP实时荧光定量和现场检测方法具有灵敏、特异和快速等特点,为近几年新发虾类病原DIV1的定性、定量以及现场快速检测提供了新的技术选择,有利于对虾养殖业中开展DIV1的监测、预警和防控。

大熊猫轮状病毒可视化LAMP检测技术的建立及应用

根据大熊猫轮状病毒CH–1株VP4基因设计3对引物,建立大熊猫轮状病毒可视化环介导等温扩增(LAMP)检测技术,对其反应条件进行优化及特异性和灵敏度进行验证。结果表明:用可视化LAMP方法检测大熊猫轮状病毒时,在62℃条件下,反应体系中加入终浓度为8 mmol/L Mg^2+、0.6 mol/L甜菜碱、12 U Bst DNA聚合酶和1×LAMP可见光染料,扩增40 min后,阳性样本颜色由紫色变为蓝色,电泳分析扩增产物可观察到明显的梯状条带;用建立的LAMP方法对大熊猫轮状病毒进行扩增,特异性好;其批内及批间的变异系数均小于1%,重复性好;其最低检测限为5×10^–5 ng/μL RNA,灵敏度比常规PCR高约100倍;采用该方法检测50份大熊猫粪便样的轮状病毒,共检测到阳性样本22份,比常规PCR方法检测到的阳性样本多5份,与荧光定量PCR方法的吻合度为100%。可见,用LAMP方法检测大熊猫轮状病毒具有操作简便、反应时间短、特异性强、结果判定快速等特点,可用于临床上大熊猫轮状病毒的快速检测。

猪圆环病毒2型LAMP检测方法的建立

猪圆环病毒2型属于圆环病毒科圆环病毒属,是引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原。该病在世界范围内广泛流行,给我国养猪业造成一定的经济损失。目前针对PCV-2的检测技术还有提升的空间,因此本研究针对PCV-2的Cap基因高度保守的区域作为靶序列设计引物,建立了一种可快速、灵敏、特异地检测PCV-2的LAMP检测方法。

快速检测NDM-1基因的环介导恒温扩增技术的建立与评价

基于DNA环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),探索建立一种应用于NDM-1基因(New Metallo-β-Lactamase-1 Gene,NDM-1)的快速检测方法,以适应临床实验室等的检测需求。利用LAMP技术,以NDM-1基因为靶序列,设计4组LAMP引物,并筛选最优引物组,建立LAMP反应体系与条件,进行灵敏度和特异性实验。结果表明整个检测过程仅需1 h,即可通过肉眼直接目测实验结果。在灵敏度试验中,NDM-1基因的最低检测限为6拷贝/反应。在特异性实验中,以4株病原菌(肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌)以及肠道菌群元基因组DNA、土壤菌群元基因组DNA为模板对NDM-1基因进行检测,结果显示均没有发生非特异性扩增反应。文中建立的LAMP检测方法能够快速检测NDM-1基因,且可直接观察到实验结果,实现了检测结果的可视化。具有操作简单安全、检测灵敏度高、特异性高的特点,能够满足基层实验室、应急检测或现场监测等方面的使用需求,具有良好的应用价值。

逆转录环介导等温扩增技术检测HIV-1方法的建立及颜色判定法的改良

目的 基于逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）技术建立可用于现场检测HIV-1的方法.方法 构建实时荧光检测法时,先测试其特异性和灵敏度,并对其定量检测进行探索,然后用35份HIV-1阳性样本对该方法进行评定；在颜色判定法上,先对羟基萘酚蓝（HNB）进行改良,并验证其实际显色效果,然后选取效果明显的样本进行显色灵敏度测试和35份阳性样本显色评定.结果 实时荧光法对HIV-1有很好的检测特异性,灵敏度可达每反应管10 ～ 100拷贝数RNA.该方法对所有阳性临床样本均100％ （35/35）检出,无一漏检,但其定量检测只局限于不低于每反应管103拷贝数.通过改良得到3种易分辨的HNB改良型显色剂,显色灵敏度等同于琼脂糖凝胶电泳级别,对35份HIV-1阳性样本的显色判定也无一漏检.结论 基于RT-LAMP技术的现场实时荧光法和改良型颜色判定法可以为真正实现现场快速、准确和灵敏检测HIV-1提供帮助.

屋尘螨过敏原Der p 1基因逆转录环介导等温扩增可视化检测方法的建立

目的 建立一种能快速、准确检测环境中屋尘螨过敏原Der p 1基因的逆转录环介导等温扩增可视化(RT-LAMP)技术。方法 用Primer Explore 4.0对Der p 1基因进行RT-LAMP引物设计与筛选,提取屋尘螨、粉尘螨、热带无爪螨、腐食酪螨总RNA,利用优化的RT-LAMP反应体系分别扩增4个螨种的Der p 1基因,评价方法的特异度和灵敏度。采集74份哮喘患儿的床尘样品,提取总RNA进行Der p 1基因RT-PCR和RT-LAMP检测。结果 利用优化的RT-LAMP方法检测4种螨的Der p 1基因,只有屋尘螨阳性,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物呈现特征性梯形条带,肉眼和紫外灯下均观察到绿色荧光。建立的RT-LAMP对Der p 1基因的最小检测量为1.0×10^(-6 )μg,敏感性比常规RT-PCR高10倍;检测74份床尘样品,阳性率85.1%,与RT-PCR阳性率70.3%比较差异具有统计学意义(χ^(2)=4.72,P<0.05)。结论 建立的屋尘螨过敏原Der p 1基因RT-LAMP较常规RT-PCR灵敏度和特异性更高,可用于屋尘螨过敏原污染的快速检测。

环介导等温扩增技术检测单纯疱疹病毒Ⅰ型的应用

目的建立一种用于检测单纯疱疹病毒-Ⅰ型(HSV-1)的环介导等温扩增技术(LAMP)检测方法。方法用病毒DNA提取试剂盒提取HSV-1基因组DNA。设计4条扩增HSV-1糖蛋白gG基因的LAMP引物,对HSV-DNA进行LAMP,扩增产物进行琼脂糖电泳和酶切鉴定(试验设HSV-2、HPV-6、HPV-11、沙眼衣原体对照和阴性对照);并对3例临床标本进行LAMP检测。结果 HSV-1 LAMP产物电泳后呈LAMP特征性条带,对照组无扩增条带;扩增产物AvaⅠ酶切片段大小分别为182、140和62 bp,与理论值相符。用HSV-1 LAMP引物扩增3例口唇疱疹标本,2例标本出现LAMP条带,1例标本未扩增出条带。结论建立的LAMP方法简便、高效、快速,可用于HSV-1感染检测。

基于荧光重组酶介导等温扩增技术的利什曼原虫核酸检测方法的建立

目的建立一种基于荧光重组酶介导等温扩增(recombinase-aided isothermal amplification,RAA)技术的检测利什曼原虫核酸的方法。方法针对利什曼原虫内转录间隔基因序列1(ITS1)基因设计用于RAA检测的特异性引物和探针,通过引物配对筛选、引物和探针浓度优化,建立检测利什曼原虫核酸的荧光RAA法。分别以构建的含利什曼原虫ITS1基因序列的不同拷贝数重组质粒和不同浓度利什曼原虫基因组DNA为模板进行RAA扩增,评估其检测灵敏度;以田鼠巴贝西虫、刚地弓形虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫、杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫等其他经输血传播的寄生虫基因组DNA为模板进行RAA扩增,评价其检测特异度。结果从9对引物组合中筛选出1对最佳引物对后,引物和探针终浓度经优化分别确定为0.3μmol/L和0.08μmol/L。所建立的荧光RAA法在39℃等温条件下20 min内可完成样本核酸检测。采用建立的RAA法对田鼠巴贝西虫、刚地弓形虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫、杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫等8种寄生虫基因组DNA进行检测,杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫基因组DNA在5 min内即出现明显荧光信号,与田鼠巴贝西虫、刚地弓形虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫无交叉反应。以含利什曼原虫ITS1基因序列的重组质粒为模板,荧光RAA法最低检测限为10拷贝/μL;以利什曼原虫基因组DNA为模板,荧光RAA法最低检测限为1 fg/μL。结论成功建立了一种基于荧光RAA法的利什曼原虫核酸检测技术,该方法反应快速、操作简便、灵敏度和特异度均较高,可用于利什曼原虫病流行区现场筛查。