六味地黄汤通过miR-210/HIF-1α信号通路对CoCl_(2)诱导的HK-2细胞上皮间质转化的影响和机制研究

目的观察六味地黄汤(Liuwei Dihuang Decoction,LWDHD)调控miR-210/HIF-1α信号通路对CoCl_(2)诱导的HK-2细胞上皮间质转化(epithelial mesenchymal transdifferentiation,EMT)的作用和机制。方法体外培养HK-2细胞,分对照组(N组)、模型组(M组)、LWDHD血清组(LW组)、空白血清+miR-210过表达组(LV-miR-210组)、空白血清+mi R-210沉默组(LV-antimi R-210组)、空白血清+miR-210阴性对照组(LV-miR-210 NC组)、LWDHD血清+miR-210过表达组(LW+LV-miR-210组)、LWDHD血清+mi R-210沉默组(LW+LV-anti-miR-210组)、LWDHD血清+miR-210阴性对照组(LW+LV-miR-210 NC组),除N组外,其他各组加入CoCl_(2)处理。CCK-8法检测不同浓度LWDHD、CoCl_(2)在24 h后对HK-2细胞活性的影响并选择最佳干预浓度。细胞免疫荧光和Western blot法检测各组HK-2细胞中缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)、β-联蛋白(β-catenin)、波形蛋白(Vimentin)、上皮钙黏素(E-cadherin)蛋白表达情况;qPCR法检测miR-210、HIF-1α、β-catenin、Vimentin m RNA表达情况。通过慢病毒感染HK-2细胞,实现miR-210的过表达和抑制,并加入CoCl_(2),观察miR-210、HIF-1α、β-catenin、Vimentin蛋白和mRNA表达以及LWDHD的干预作用。结果CCK-8结果显示,LWDHD、CoCl_(2)最佳干预浓度分别为10%、200μmol/L。与N组相比,M组细胞形态由铺路石样向长梭形改变,HIF-1α、β-catenin、Vimentin蛋白和mRNA表达升高(P<0.05,P<0.01),mi R-210m RNA表达升高(P<0.01),E-cadherin蛋白表达降低(P<0.01);与M组相比,LW组HIF-1α、β-catenin、Vimentin蛋白和mRNA表达降低(P<0.05,P<0.01),miR-210 mRNA表达降低(P<0.05),E-cadherin蛋白表达升高(P<0.01)。与LV-miR-210 NC组相比,LVanti-miR-210组HIF-1α、β-catenin、Vimentin蛋白和mRNA表达降低(P<0.05,P<0.01);与LV-miR-210 NC组相比,LV-miR-210组HIF-1α、β-catenin、Vimentin蛋白和mRNA表达升高(P<0.05,P<0.01)。在慢病毒转染各组的基础上,加入LWDHD处理后,LWDHD可降低各组HIF-1α、β-catenin、Vimentin蛋白和mRNA表达(P<0.05,P<0.01)。结论LWDHD抗纤维化作用机制与其下调miR-210/HIF-1α信号通路,抑制肾小管EMT有关。

卡托普利对白蛋白引起HK-2细胞ACE/ACE2表达的影响

目的观察血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)卡托普利(captopril,CAP)对白蛋白引起的肾小管上皮细胞表达ACE、ACE2及其作用产物AngⅡ的影响。方法实验分组:对照组(未干预的人近端肾小管上皮细胞株,HK-2);牛血清白蛋白(BSA)组(10 mg.ml-1);CAP组(10μmol.L-1);BSA加CAP组。分别采用实时定量RT-PCR和Western Blot检测ACE、ACE2 mRNA和蛋白的表达水平;采用放射免疫法(RIA)检测细胞上清液中AngⅡ的浓度。结果实时定量RT-PCR显示,与对照组比较(相对表达量为0),CAP组ACE mRNA表达差异无统计学意义(0.27±0.09 vs 0,P>0.05);CAP能显著抑制BSA引起的ACE mRNA表达上调[(BSA+CAP)组∶BSA组为(0.80±0.05)vs(1.58±0.20),P<0.05]。同时,由BSA引起的ACE2 mRNA表达下调作用也被显著抑制[(BSA+CAP)组∶BSA组为(-0.59±0.08)vs(0.24±0.11),P<0.05]。Western Blot显示BSA引起的ACE蛋白表达增加被显著抑制[(BSA+CAP)组∶BSA组为(0.85±0.09)vs(1.2±0.10),P<0.05],而ACE2蛋白表达的减少也明显减轻[(BSA+CAP)组∶BSA组为(0.49±0.09)vs(0.35±0.09),P<0.05]。RIA结果显示CAP可显著抑制BSA引起的细胞上清液中AngⅡ浓度增加[(BSA+CAP)组∶BSA组为(55.25±4.8)vs(97.25±10.4)pg.ml-1,P<0.05]。结论CAP可通过抑制ACE和增加ACE2表达而抑制白蛋白所引起的HK-2细胞肾素-血管紧张素系统激活。

基于Smads信号通路探讨止消通脉宁干预TGF-β_1诱导HK-2细胞转分化的研究

目的:探讨止消通脉宁含药血清对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)转分化Smad信号通路的影响。方法:将HK-2细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培养基培养;实验分为6组:空白对照组、单纯TGF-β1诱导组(TGF-β110 ng/mL)、空白血清对照组(TGF-β110 ng/mL+10%空白血清)、中药含药血清低剂量组(TGF-β110 ng/mL+10%低剂量止消通脉宁含药血清)、中药含药血清中剂量组(TGF-β110 ng/mL+10%中剂量止消通脉宁含药血清)、中药含药血清高剂量组(TGF-β110 ng/mL+10%高剂量止消通脉宁含药血清)。药物干预24小时后,荧光定量PCR检测TβRI、TβRⅡ的mRNA表达,Western blot检测Smad 2、Smad 3的蛋白表达。结果:HK-2细胞经TGF-β1诱导后,TβRI、TβRⅡ的mRNA表达和Smad 2、Smad 3的蛋白表达显著上升,与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),经止消通脉宁含药血清干预后,其表达逐步下降,与单纯TGF-β1诱导组相比差异有统计学意义(P<0.05)。而空白血清无此作用。结论:止消通脉宁能够调控TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞转分化Smad信号通路,在一定程度上具有抑制肾间质纤维化的作用。

LX-2与HK-2细胞共培养模型的建立及对其细胞转分化的影响

[目的]建立人肝星状细胞(LX-2)与人肾小管上皮细胞(HK-2)共培养体系的理论模型,研究LX-2对HK-2转分化的影响。[方法]以Transwell小室建立体外LX-2细胞和HK-2细胞间接共培养体系。应用细胞免疫组织化学法检测HK-2细胞平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达;用酶联免疫吸附法(ELISA法)检测各组细胞培养液中转化生长因子-β1(TGF-β1)的含量;逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR法)检测HK-2细胞TβRⅠm RNA、TβRⅡm RNA、Smad2 m RNA、Smad3 m RNA、Smad7 m RNA的表达。[结果]除了空白组,形态学上其他两组均可看到HK-2细胞胞浆染棕黄色,不同数量细胞由立方铺路石样转变为梭形长条状,细胞肥大;HK-2细胞高表达α-SMA(P<0.01);HK-2细胞上清液中TGF-β1含量明显高于空白组(P<0.01);HK-2细胞TβRⅠ、Smad2、Smad3基因表达明显上调,而TβRⅡ、Smad7基因表达明显下调。[结论]Transwell共培养法可诱导HK-2细胞转分化,其机制可能与TGF-β1/Smad信号通路有关。

止消通脉宁对TGF-β_1诱导的HK-2细胞Smad2、3、7 mRNA表达的影响

目的:探讨止消通脉宁对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)Smad 2、Smad 3、Smad 7的影响。方法:将HK-2细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养基培养;实验分为6组:空白对照组、单纯TGF-β1诱导组(TGF-β110 ng/mL)、空白血清对照组(TGF-β110 ng/mL+10%空白血清)、中药含药血清低剂量组(TGF-β110 ng/mL+10%低剂量止消通脉宁含药血清)、中药含药血清中剂量组(TGF-β110 ng/mL+10%中剂量止消通脉宁含药血清)、中药含药血清高剂量组(TGF-β110 ng/mL+10%高剂量止消通脉宁含药血清)。药物干预24小时后,荧光定量PCR检测Smad 2、smad 3、Smad 7的mRNA表达。结果:HK-2细胞经TGF-β1诱导后,Smad 2、smad 3的mRNA表达显著上升,Smad 7的mRNA表达下降,与空白对照组相比有显著性差异(P<0.05),但经止消通脉宁含药血清干预后,Smad 2、smad 3的mRNA表达逐步下降,Smad 7的mRNA表达上调,与单纯TGF-β1诱导组相比有显著性差异(P<0.05)。而空白血清无此作用。结论:止消通脉宁能够调控TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞转分化Smad信号通路mRNA表达的作用,在一定程度上具有抑制肾间质纤维化的作用。

T-2毒素对人肾小管上皮细胞HK-2体外增殖和凋亡的影响

探讨T-2毒素对人肾小管上皮细胞HK-2体外增殖和凋亡的影响。将体外培养的HK-2细胞,经不同浓度的T-2毒素作用72 h后,分别测定T-2毒素对HK-2细胞增殖抑制率、细胞形态、DNA片段化、细胞凋亡率、细胞周期分布和caspase-3活性的影响。结果表明,T-2 毒素对HK-2细胞具有增殖抑制作用,抑制率随浓度升高而增大,IC 50 值为49.34 nmol/L。T-2毒素在10~40 nmol/L可剂量依赖性的诱导HK-2细胞凋亡,且20 nmol/L下HK-2细胞即可出现染色质固缩等凋亡细胞的典型特征。同时,10~40 nmol/L,T-2毒素可通过引起G 2 /M期阻滞影响细胞的周期分布。此外,T-2毒素在10~40 nmol/L下可引起caspase-3活性剂量依赖性增强,与对照组相比,最大可提高1.93倍( P <0.05)。因此,该研究为阐明T-2毒素的肾脏毒性作用机制提供了理论依据。

人血白蛋白对近端肾小管上皮细胞ACE2表达的影响

目的:研究人血白蛋白对人近端肾小管上皮细胞(HK-2)血管紧张素转换酶2(ACE2)及血管紧张素转换酶(ACE)表达的影响,探讨白蛋白对肾脏损害的机制。方法:不同浓度人血白蛋白(0、1、5、10、15g/L)分别加入到培养的人近端肾小管上皮细胞培养48h,用RT-PCR法和Western blotting法分别检测HK-2细胞ACE2和ACEmRNA和蛋白表达。结果:正常培养状态下HK-2细胞(空白对照组)存在ACE2mRNA和蛋白表达,加入不同浓度(5-15g/L)的人血白蛋白剂量依赖抑制HK-2细胞ACE2mRNA和蛋白表达(P<0.01)。正常培养状态下HK-2细胞ACEmRNA和蛋白表达水平较低,随着加入白蛋白浓度的增加其表达水平逐渐升高,10g/L白蛋白显著促进了HK-2细胞ACEmRNA和蛋白表达(P<0.05)。结论:在体外培养的HK-2细胞存在ACE及ACE2mRNA和蛋白表达,人血白蛋白可抑制其ACE2表达而促进ACE表达,这可能是白蛋白促肾小管间质损伤及肾小球硬化、间质纤维化的机制之一。

Hexokinase 2在卵巢癌中的表达及临床病理意义

目的:探讨卵巢癌中Hexokinase 2(HK-2)表达的临床病理意义。方法:免疫组化检测56例卵巢癌组织及10例癌旁组织中HK-2的表达情况,并对临床病理数据进行分析。MTT法和流式细胞分析分别检测siRNA沉默HK-2蛋白对卵巢癌Skov3细胞增殖及凋亡的影响。Western Blot检测凋亡蛋白Caspase-3的表达。结果:10例癌旁组织中均未见HK-2阳性表达,56卵巢癌中HK-2的阳性表达率为53.6%(30/56)。HK-2高表达与卵巢癌患者肿瘤分期较高(P=0.018)、肿瘤淋巴结转移密切相关(P=0.035),但与患者年龄(P=0.410)、肿瘤组织学分级(P=0.108)、肿瘤组织学类型(P=0.122)、复发(P=0.160)无显著相关性。siRNA沉默HK-2蛋白抑制卵巢癌Skov3细胞增殖,促进凋亡。Western Blot检测蛋白提示siRNA沉默HK-2蛋白促进了调亡蛋白Caspase-3的表达。结论:卵巢癌中存在HK-2高表达,HK-2在卵巢上皮癌可能发挥了促进肿瘤发生和进展的重要作用,可能是一种新的上皮卵巢癌治疗靶点。

丙酮酸激酶通过靶向Bcl-2家族参与脂多糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡

目的探讨丙酮酸激酶2(PKM2)在脂多糖(LPS)诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)凋亡中的作用及分子机制。方法采用不同质量浓度的脂多糖作用于HK-2细胞,利用CCK-8实验检测细胞存活率;利用Real-time PCR、Western blot检测HK-2细胞中PKM2的mRNA及蛋白表达水平;利用Western blot检测Bcl-2家族关键蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)以及细胞色素C(Cytochrome C)的表达;利用Annexin-PE/7AAD双染法分析细胞凋亡水平;利用流式细胞术PI染色法检测细胞周期,并结合PKM2抑制剂,深入探讨PKM2在其中的作用及机制。结果脂多糖可诱导HK-2细胞损伤,使其活性降低、周期阻滞、凋亡增加,且可检测到Bcl-2家族关键蛋白的表达改变:Bcl-2降低、Bax增高,同时伴Cytochrome C增加。脂多糖可诱导PKM2表达增加,而使用PKM2抑制剂后,进一步增加了HK-2细胞凋亡以及细胞G1-S期阻滞,伴Bcl-2显著降低,Bax、Cytochrome C显著增加。结论脂多糖诱导HK-2细胞活力下降,周期阻滞,凋亡增加,PKM2可以通过靶向Bcl-2家族参与脂多糖诱导的HK-2细胞凋亡。

线粒体未折叠蛋白反应在棕榈酸诱导肾小管上皮细胞脂质聚集中的作用

目的探讨线粒体未折叠蛋白反应(mitochondrial unfolded protein reaction,UPR^(mt))对肾小管上皮细胞(human kidney 2,HK-2)脂代谢的影响。方法采用棕榈酸(palmitic acid,PA)诱导HK-2细胞内脂质聚集,分别予siRNA抑制UPR^(mt)或巴多索隆(the 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic acid,CDDO)增强UPR^(mt)。油红染色观察细胞内脂质聚集情况,线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)测定线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP),Mito-SOX测定线粒体内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量,Western blotting检测HSP60、LONP1、CLPP、ACOX1、PPARα、PGC1α、CPT1α蛋白表达。结果PA诱导HK-2细胞脂质聚集、MMP降低、ROS产生增多及UPR^(mt)关键蛋白HSP60、LONP1表达降低;抑制UPR^(mt)可加剧PA导致的脂质聚集、MMP降低、ROS产生增多,HSP60、LONP1表达进一步降低;增强UPR^(mt)可缓解PA导致的脂质聚集、MMP降低、ROS产生增多以及HSP60、LONP1表达降低。结论PA诱导的HK-2细胞脂质聚集可能与线粒体功能障碍有关,UPR^(mt)在该过程中对HK-2细胞具有保护作用。

六味地黄汤含药血清对HK-2细胞PHD2／HIF-1α信号途径的影响

目的以缺氧诱导的HK-2细胞为研究对象,探讨脯氨酸羟化酶2/缺氧诱导因子1α(PHD2/HIF-1α)信号途径对肾间质纤维化的影响,以及六味地黄汤含药血清干预作用。方法 40只SPF级雄性SD大鼠分为空白组和给药组,每组20只,空白组以10 m L/(kg·d)生理盐水,给药组以67.5 g/(kg·d)六味地黄汤灌胃连续1周,腹主动脉取血,离心后分离血清。体外培养HK-2细胞,将实验分为空白对照组(10%胎牛血清)、正常血清组(10%正常大鼠血清)、氯化钴(Co Cl2)处理组(150μmol/LCo Cl2+10%正常大鼠血清)和含药血清组(150μmol/LCo Cl2+10%六味地黄汤含药血清)。体外培养HK-2,分组处理24 h后,用Western Blot法和RT-PCR法分别检测六味地黄汤含药血清对缺氧诱导的HK-2细胞中PHD2、HIF-1α、结缔组织生长因子(CTGF)的蛋白水平和mRNA表达的影响。结果与正常血清组比较,Co Cl2处理组HK-2细胞中PHD2的蛋白水平和mRNA表达均降低(P<0.05),而HIF-1α、CTGF的蛋白水平和mRNA表达均升高(P<0.05);与Co Cl2处理组比较,含药血清组HK-2细胞中PHD2的蛋白水平和mRNA表达均升高(P<0.05),而HIF-1α、CTGF的蛋白水平和mRNA表达均降低(P<0.05)。结论 PHD2/HIF-1α信号途径参与肾间质纤维化,六味地黄汤可能通过上调PHD2的表达,促进HIF-1α的降解,后者下调CTGF的表达,从而抑制肾间质纤维化。

铅抑制NF-κB、Bcl-2蛋白表达诱导人肾小管上皮细胞凋亡

目的研究醋酸铅对人肾小管上皮细胞系HK-2细胞NFκB、Bcl-2表达的影响及与细胞凋亡的关系。方法体外培养HK-2细胞分为0、2.5、5、10、20μmol/L醋酸铅组,分别染毒72h,应用间接免疫荧光-流式细胞术检测HK-2细胞NF-κB、Bcl-2蛋白表达的改变,用Annexin-V/PI双染法检测细胞凋亡。结果随着染铅剂量增加HK-2细胞NF-κB、Bcl-2蛋白表达逐步降低,NF-κB与Bcl-2降低显著相关(r=0.71,P<0.01);细胞凋亡率随着铅剂量增加而增加,在5、10、20μmol/L铅组与对照组比较差别有统计学意义(P<0.01);细胞凋亡率与NF-κB、Bcl-2蛋白表达呈明显负相关(r=-0.625,P<0.01;r=-0.709,P<0.01)。结论醋酸铅能下调HK-2细胞NF-κB、Bcl-2基因的表达,这可能是其诱导HK-2细胞凋亡的途径之一。

丙酮醛对人肾近端小管上皮细胞损伤的作用及机制

目的探讨丙酮醛对人肾近端小管上皮细胞(HK-2细胞)损伤的作用及可能机制。方法采用不同浓度的丙酮醛(100、200、400、800、1 600μmol/L)处理HK-2细胞24 h后,应用CCK-8法检测HK-2细胞的存活率;罗丹明123染色法检测细胞线粒体膜电位;DAPI染色法观察HK-2细胞凋亡形态学变化。Western blot法检测HK-2细胞内磷酸化ERK1/2(phosphated ERK1/2,p-ERK1/2)、Bax及cleaved-caspase-3蛋白表达水平。结果与对照组相比,不同的浓度的丙酮醛均能降低HK-2细胞存活率(P<0.01);且HK-2细胞经丙酮醛诱导后cleaved-caspase-3(P<0.01)、Bax及p-ERK1/2蛋白表达水平均明显增高(P<0.05)。结论丙酮醛能诱导HK-2细胞出现明显的损伤及凋亡,其机制可能与其激活ERK1/2信号通路有关。

N-乙酰半胱氨酸对丙酮醛诱导的人肾小管上皮细胞损伤的保护作用及机制研究

目的探讨N-乙酰半胱氨酸(NAC)对丙酮醛引起人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)损伤的保护作用及其可能机制。方法 HK-2细胞分为6组:对照组、丙酮醛组、丙酮醛+不同浓度NAC(1、2、4及8 mmol/L)处理组。采用CCK-8检测细胞活力,DAPI染色观察细胞核形态,罗丹明123染色及流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位,Western blot检测抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase-3以及磷酸化ERK1/2(pERK1/2)蛋白表达水平。结果与对照组比较,HK-2细胞经400μmol/L丙酮醛处理后,细胞活力、线粒体膜电位及Bcl-2蛋白表达水平降低,凋亡细胞数增多,Bax、Cleaved Caspase-3及p-ERK1/2蛋白表达水平则升高。而经不同浓度的NAC干预后,可以逆转丙酮醛对HK-2细胞的上述作用。结论 NAC对丙酮醛诱导的HK-2细胞损伤具有保护作用,其机制可能与其抗凋亡及抑制ERK1/2信号通路有关。

NOL1/NOP2/Sun RNA甲基转移酶家族成员2在肾脏缺血再灌注损伤中的作用

目的构建肾脏缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)小鼠及细胞模型,观察NOL1/NOP2/Sun RNA甲基转移酶家族成员2(NOL1/NOP2/Sun domain family member 2,Nsun2)表达变化,探讨Nsun2在肾脏IRI中的作用。方法雄性C57BL/6N小鼠12只,随机分为IRI-3组、IRI-6组、IRI-24组和假手术组各3只。使用无损伤显微血管夹夹闭小鼠肾蒂使肾脏缺血30 min,随后移除血管夹恢复肾脏血流,IRI-3组、IRI-6组、IRI-24组分别再灌注3、6、24 h;假手术组仅做手术切口和缝合,不做其他处理。IRI-3组、IRI-6组和IRI-24组小鼠分别于再灌注3、6、24 h时,假手术组小鼠于再灌注24 h时检测血肌酐水平。取血后处死小鼠取左肾组织,行HE染色检测4组肾脏组织病理变化,行免疫荧光染色检测IRI-24组和假手术组肾脏组织Nsun2表达,采用Western blot法检测4组肾脏组织Nsun2、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)相对表达量。取人近端肾小管上皮HK-2细胞,分别应用0、100、200μmol/L CoCl_(2)处理24 h后更换正常培养基继续培养2 h,采用Western blot法检测Nsun2、Bax、Bcl-2蛋白相对表达量,确定构建IRI细胞模型的CoCl_(2)处理最适宜浓度为200μmol/L。取HK-2细胞分为siRNA-NC组、siRNA-Nsun2组,分别转染2.5μL 20μmol/L的siRNA-NC和2.5μL 20μmol/L的siRNA-Nsun2,转染6 h后培养24 h,采用Western blot法检测2组细胞Nsun2蛋白相对表达量。取siRNA-NC组、siRNA-Nsun2组细胞,应用200μmol/L CoCl_(2)处理24 h后培养2 h,分别为siRNA-NC+IRI组和siRNA-Nsun2+IRI组,采用Western blot法检测siRNA-NC组、siRNA-NC+IRI组、siRNA-Nsun2+IRI组细胞Bcl-2、Bax蛋白相对表达量,采用流式细胞术检测细胞凋亡率。结果IRI-3、IRI-6、IRI-24组血肌酐水平[(44.44±2.96)、(49.91±5.65)、(56.41±5.13)μmol/L]均高于假手术组[(27.35±2.96)μmol/L](P<0.05),IRI-24组高于IRI-3组(P<0.05)。假手术组肾小球及间质细胞正常,肾小管上皮细胞结构完整,IRI-3组、IRI-6组、IRI-24组肾小球及间质细胞正常,肾小管上皮细胞出现空泡和颗粒化变性、崩解以及管腔堵塞,且24 h内再灌注时间越长,病理改变越重。免疫荧光染色结果显示,Nsun2定位于细胞核,呈点状分布;IRI-24组近端肾小管上皮细胞Nsun2表达明显多于假手术组。IRI-24组肾脏组织Nsun2蛋白相对表达量(0.33±0.03)高于假手术组、IRI-3组、IRI-6组(0.17±0.01、0.22±0.05、0.25±0.01)(P<0.05),IRI-6组高于假手术组(P<0.05);IRI-3组、IRI-6组、IRI-24组肾脏组织Bax蛋白相对表达量(0.52±0.04、0.54±0.06、0.44±0.04)均高于假手术组(0.14±0.01)(P<0.05),IRI-3组、IRI-6组均高于IRI-24组(P<0.05);IRI-6组、IRI-24组肾脏组织Bcl-2蛋白相对表达量(0.17±0.08、0.03±0.02)均低于假手术组、IRI-3组(0.39±0.13、0.34±0.07)(P<0.05)。200μmol/L CoCl_(2)组细胞Nsun2、Bax蛋白相对表达量(0.53±0.04、0.66±0.04)均高于0μmol/L CoCl_(2)组(0.31±0.02、0.28±0.01)和100μmol/L CoCl_(2)组(0.34±0.02、0.52±0.04)(P<0.05),Bcl-2蛋白相对表达量(0.24±0.01)均低于0μmol/L CoCl_(2)组和100μmol/L CoCl_(2)组(0.56±0.02、0.37±0.01)(P<0.05);100μmol/L CoCl_(2)组细胞Bax蛋白相对表达量高于0μmol/L CoCl_(2)组(P<0.05),Bcl-2蛋白相对表达量低于0μmol/L CoCl_(2)组(P<0.05)。siRNA-Nsun2组细胞Nsun2蛋白相对表达量(0.33±0.02)低于siRNA-NC组(0.64±0.07)(P<0.05)。siRNA-NC+IRI组细胞Bax蛋白相对表达量(0.61±0.03)及细胞凋亡率[(8.63±1.00)%]均高于siRNA-NC组[0.48±0.02、(1.93±0.55)%](P<0.05),Bcl-2蛋白相对表达量(0.44±0.05)低于siRNA-NC组(0.79±0.02)(P<0.05);siRNA-Nsun2+IRI组细胞Bax蛋白相对表达量(0.32±0.02)及细胞凋亡率[(5.33±1.12)%]均低于siRNA-NC+IRI组(P<0.05),Bcl-2蛋白相对表达量(0.63±0.03)高于siRNA-NC+IRI组(P<0.05)。结论IRI小鼠肾脏组织及IRI肾小管上皮细胞HK-2中Nsun2表达上调,下调Nsun2表达可抑制IRI肾小管上皮细胞凋亡。

万古霉素诱导人肾小管上皮细胞损伤及其Smad4表达的研究

目的 研究万古霉素诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)损伤及其Smad同源物4(Smad4)表达,并探讨其潜在的作用机制。方法 使用不同终浓度(0、1、2、3、4、5 mmol/L)的万古霉素溶液作用于HK-2细胞24 h,显微镜下观察万古霉素对细胞形态的影响;蛋白质免疫印迹法检测Smad4、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)、Bcl-2的蛋白水平;TUNEL法检测HK-2细胞凋亡情况;CCK8法检测HK-2细胞活力来研究万古霉素对肾脏的毒性作用。构建Smad4过表达质粒,通过CCK8法和TUNEL实验检测Smad4过表达对万古霉素诱导的HK-2细胞损伤的影响。结果 与对照组比较,随着万古霉素浓度升高,HK-2细胞逐渐变形,数量逐渐减少;细胞活力显著降低,凋亡率显著增加(P<0.05、0.01)。与对照组比较,促凋亡蛋白Bax表达显著增高,而抗凋亡蛋白Smad4、Bcl-2表达则显著降低(P<0.05、0.01、0.001)。过表达Smad4后,使万古霉素诱导的HK-2的细胞活力显著增加,凋亡率显著降低(P<0.05、0.001)。结论 万古霉素能够诱导人肾小管上皮细胞损伤,其作用机制可能与调控Smad4的蛋白降解密切相关。

氟伐他汀及高糖对人肾小管上皮细胞klotho蛋白表达的影响

目的探讨高糖(HG)及氟伐他汀对人肾小管上皮细胞2(HK-2)klotho蛋白表达的影响及机制。方法正常糖(NG,5.5mmol/L),HG(25.0mmol/L)培养HK-2,不同浓度氟伐他汀(0.1、1.0、10μmol/L)伴/不伴甲羟戊酸(MVA)、焦磷酸牛龙牛儿基牛龙牛儿酯(GGPP)、焦磷酸法尼酯(FPP),干预不同时间(0、12、24、48h),Western blot检测klotho、RhoA蛋白表达。结果与NG培养比较,HG刺激HK-2表达klotho蛋白量明显减少(P<0.05);氟伐他汀干预后部分恢复(与HG刺激比较,P<0.05);此作用可被MVA、GGPP逆转,FPP不能逆转。HK-2RhoA蛋白量在HG刺激下增加(与NG培养比较,P<0.05),氟伐他汀干预后表达减少(P<0.05)。结论 HG抑制HK-2klotho蛋白表达;氟伐他汀上调HK-2表达klotho蛋白,机理可能与其抑制RhoA/Rho激酶信号通路有关。