几种克服昆明小鼠 2- 细胞胚胎发育阻滞的培养液研究

比较了几种培养液对克服昆明小鼠胚胎 2 细胞发育阻滞的效果。实验 1的结果表明 ,在M16及CZB培养液基础上 ,加减几种成分得到的改进M16培养液 (用mM 16表示 )和改进的CZB培养液 (用mCZB表示 )均能有效克服 2 细胞阻滞现象。除去M 16和CZB培养液中的葡萄糖和磷酸盐后添加 5 5 5mmol/L (1g/L)果糖、2 5mmol/L牛磺酸、 10 0或110 μmol/LEDTA、 2mmol/L谷氨酰胺和 2 %必需氨基酸 (EAA)及 1%非必需氨基酸(NEA) ,均可支持体外培养的昆明小鼠 1 细胞胚胎发育到囊胚和孵化囊胚阶段。实验结果同时证明 ,TE培养液也具有良好的培养效果。 1 细胞胚胎在mM 16、TE和mCZB中培养后发育到囊胚的比率分别为 85 %、 85 %和 6 8%。实验 2的结果表明 ,在M 16培养液中单独添加 2 5mmol/L的牛磺酸也可支持体外培养的昆明小鼠 1 细胞胚胎发育到囊胚。在M16中同时添加 2 5mmol/L牛磺酸和 10 0 μmol/LEDTA两种成分可使 1 细胞胚胎的囊胚发育率达到 6 7%。通过比较分析我们认为牛磺酸对克服昆明小鼠胚胎 2 细胞阻滞起关键作用 。

M16添加硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ无法克服昆明小鼠早胚体外发育2-细胞阻滞

目的观察硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ(Peroxiredoxin Ⅱ,PrxII)是否可以克服昆明(Kunming)小鼠早胚体外发育2-细胞阻滞。方法取昆明小鼠1-细胞胚置于含PrxII蛋白的M16培养液中培养,观察PrxII对昆明小鼠早胚发育潜能和2-细胞胚内活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)水平的影响;同时比较昆明和B6C3F1小鼠1-细胞胚在M16中各自的发育情况;激光扫描共聚焦显微镜分别检测比较昆明与B6C3F1小鼠体外培养2-细胞胚内ROS水平以及昆明小鼠体外培养与体内发育2-细胞胚内ROS水平。结果M16培养液中添加PrxII蛋白(1nmol/L和100nMol/L)可以明显降低昆明小鼠体外培养2-细胞胚内ROS水平(P<0.05),但不能克服昆明小鼠体外发育2-细胞阻滞;昆明小鼠1-细胞胚在M16中培养存在2-细胞阻滞现象,而B6C3F1小鼠无2-细胞阻滞现象;昆明小鼠体外培养2-细胞胚内ROS水平显著低于体内发育2-细胞胚(P<0.05),亦略低于B6C3F1小鼠体外培养2-细胞胚内ROS水平(P>0.05)。结论M16培养液中添加PrxII可以明显降低2-细胞胚内ROS水平,但并不能克服2-细胞阻滞。与昆明小鼠体内发育2-细胞和B6C3F1体外发育2-细胞胚相比,体外培养昆明小鼠2-细胞胚内ROS水平并不升高,这些结果提示昆明小鼠体外培养出现2-细胞阻滞的原因并非是胚内ROS水平升高引起。

“生存还是毁灭”,发育还是阻滞──小鼠早胚体外发育2-细胞阻滞产生机制初析

在体外培养条件下，小鼠受精卵往往经一次分裂后就停滞在２－细胞期，不能完成到达囊胚的后续发育过程；称作２－细胞阻滞。氧自由基伤害、培养液成分不平衡等外界因素都能引起阻滞。小鼠的２－细胞阻滞现象受细胞质内母型物质制约，具有品系依赖性。在阻滞品系小鼠胚胎的细胞质内可能缺乏某些重要的蛋白因子，在无外源信号的培养体系内不能继续分裂。发生阻滞的胚胎细胞内ＭＰＦ前体物虽然储备充足，但因无法去磷酸化激活而最终导致发育阻滞。阻滞发生的时间同合子型基因激活（ＺＧＡ）开启的时间刚好相吻合，而在２－细胞阻滞的胚胎中，ＺＧＡ未开启。总之，体外培养环境的不利影响、外源信号的丧失及胚胎细胞质内母型蛋白质的匮乏都阻碍了合子钟对 ＺＧＡ的正常调控。而 ＭＰＦ的正常激活则是 ＺＧＡ后的下游事件。所以 ＺＧＡ不能开启很可能是导致 ２－细胞阻滞的关键原因。

阻滞和非阻滞品系小鼠体外发育2-细胞胚基因表达水平的比较

检测阻滞品系昆明小鼠和非阻滞品系B6C3F1小鼠体外发育2-细胞胚内基因表达水平的差异，探讨昆明小鼠植入前胚体外发育阻滞与哪些基因表达调控有关。方法：分别收集昆明小鼠和B6C3F1小鼠体外培养2-细胞胚，运用基因芯片分析和Real-timePCR验证。结果：基因芯片检测共筛出差异表达基因303个，其中昆明小鼠2-细胞胚表达上调基因有168个；下调基因有135个。昆明小鼠2-细胞胚表达上调的基因以信号转导、细胞周期、细胞结构和运动、细胞增殖和分化以及发育进程等为主；而下调基因与电子转移、蛋白质代谢和修饰、氨基酸代谢以及蛋白质靶向运输和定位等相关。结论：胚内能量供应不足和蛋白质合成障碍可能是昆明小鼠植入前胚体外发育出现2-细胞阻滞的重要原因。

硝苯地平和SK&F96365对环匹阿尼酸引起的平滑肌细胞质游离Ca^(2+)浓度升高作用的影响

目的 探讨介导 Ca2 +池操纵性 Ca2 +内流的 Ca2 +通道特性。 方法 以 Fura-2荧光探针测定细胞质游离 Ca2 +浓度 ( [Ca2 +] i)。 结果 ( 1 ) 1 0μmol/ L环匹阿尼酸 ( CPA)可触发大鼠主动脉平滑肌细胞 [Ca2 +] i的双相升高 (峰值和持续相 )。 ( 2 ) SK& F963 65( 5～ 4 0 μmol/ L)以浓度依赖性抑制 CPA触发的 [Ca2 +] i升高持续相。 ( 3 )1 μmol/ L硝苯地平阻断电压依赖性 Ca2 +通道后 ,2 0 μmol/ L SK& F963 65仍能抑制 CPA触发的 [Ca2 +] i升高持续相 ;而在 2 0μmol/ L SK& F963 65抑制 CPA触发 [Ca2 +] i升高持续相后 ,1μmol/ L硝苯地平不能产生进一步的抑制作用。 结论 电压依赖性 Ca2 +通道和 Ca2 +池操纵性 Ca2 +通道介导了 Ca2 +池操纵性 Ca2

p-CREB在小鼠植入前胚的表达及其与2-细胞阻滞的关系

目的观察p-CREB在小鼠植入前胚以及阻滞品系(昆明小鼠)与非阻滞品系(B6C3F1小鼠)2-细胞胚的分布与表达,初步探讨p-CREB在小鼠植入前胚中的作用以及与小鼠2-细胞阻滞的关系。方法利用激光扫描共聚焦显微镜检测p-CREB在B6C3F1小鼠植入前胚中的定位,比较不同品系小鼠体外培养以及B6C3F1小鼠体外培养与体内发育2-细胞胚内p-CREB的表达变化。结果p-CREB的免疫阳性反应在小鼠1-细胞胚中主要分布于细胞质中;2-细胞胚及其后期植入前胚主要定位于细胞核内;昆明小鼠体外培养2-细胞胚核内荧光强度显著低于同一条件发育的B6C3F1小鼠,B6C3F1小鼠体外培养2-细胞胚核内荧光强度显著高于体内发育。结论p-CREB在小鼠植入前胚发育中起重要作用,p-CREB在昆明小鼠2-细胞胚核内表达较低可能与小鼠2-细胞阻滞有关。

紫杉醇衍生物GT对人喉癌细胞系Hep-2的临床价值分析

目的探讨紫杉醇衍生物GT对人喉癌细胞系Hep-2的临床价值。方法 GT对Hep-2细胞的增殖抑制作用应用MTT法进行测定,通过流式细胞术及细胞形态学考察GT对Hep-2细胞诱导凋亡的作用。结果在光镜下,GT作用细胞之后能观察到较为典型的细胞凋亡的形态学变化,如染色质断片化、细胞核固缩、核碎裂、染色质凝集成新月型紧贴于核膜周边、凋亡小体形成等。明显增加G2/M期的细胞比例,典型的亚二倍体"凋亡小峰"出现。结论紫杉醇衍生物GT能够明显抑制Hep-2细胞的生长,使细胞分裂阻滞于G2/M期,对肿瘤细胞凋亡有诱导作用,值得临床进一步对其进行研究开发。

MCM2与P16在子宫颈病变细胞蜡块与活检标本中的表达

目的:探讨微型染色体维持蛋白2(minichromosome maintenance protein 2,MCM2)及P16在子宫颈病变细胞蜡块及组织学标本中的表达。方法:采用免疫组织化学染色EnVision法检测118例宫颈液基细胞学细胞蜡块,126例宫颈活检组织中MCM2及P16的表达。结果:在无上皮内病变或恶性病变(no intraepithelial or malignant lesions,NILM),意义不明的非典型鳞状细胞(atypical squamous cells with unclear significance,ACS-US),低度鳞状上皮内病变(low degree squamous intraepithelial lesion,LSIL),非典型鳞状细胞,不能排除高度鳞状上皮内病变(atypical squamous cells,cannot exclude high-grade squamous intraepithelial lesion,ASC-H)及高度鳞状上皮内病变(high degree squamous intraepithelial lesion,HSIL)的细胞蜡块样本中,MCM2的阳性率分别为0%,22%,55%,86%和92%,P16的阳性率分别为0%,9%,27%,68%和100%,差异有统计学意义(P<0.01);在宫颈上皮内瘤变1级(cervical intraepithelial neoplasia grade 1,CIN1),CIN2,CIN3和宫颈癌组织样本中,MCM2的阳性率分别为0%,50%,81%,97%和100%,P16阳性率分别为0%,18%,77%,100%和100%,差异有统计学意义(P<0.01);在人乳头瘤状病毒(human papillomavirus,HPV)16/18感染,其他高危型HPV感染以及无HPV感染的病例中,MCM2的阳性率分别为86%,36%和8%,P16的阳性率分别为89%,14%和0%,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:MCM2和P16与宫颈病变程度高度相关,可用于非典型鳞状上皮细胞及低度鳞状上皮内病变人群的分流管理。

细胞蜡块结合CDX-2、CK20、CA199在胸水转移性腺癌诊断中的应用

目的探讨细胞蜡块常规病理检查结合免疫组化标记CDX-2、CK20、CA199对胸水转移性腺癌诊断中的应用。方法收集24例可疑异型细胞且有肠腺癌病史的胸水,行液基细胞学涂片、沉渣蜡块切片,对比组织学诊断腺癌阳性率;并结合免疫组化标记行评估。结果细胞涂片及细胞蜡块腺癌细胞检出率分别为50%(12/24)、87.5%(21/24),差异有统计学差异(P<0.01)。免疫组化CDX-2、CK20、CA199在腺癌细胞蜡块中表达率分别为90.5%(19/21)、71.4%(15/21)、61.9%(13/21),而均不与TTF-1和napsin A表达重叠,差异均具有统计学意义(P<0.01)。结论细胞蜡块免疫组织化学检测较传统细胞涂片有助于提高腺癌的诊断阳性率,CDX-2、CK20、CA199联合检测对肠腺癌肺转移胸水有较高的诊断价值。

SnO_(2)致密层在染料敏化太阳能电池中的应用研究

在染料敏化太阳能电池中,半导体薄膜为其重要组成部分,是当前研究热点之一。为有效提升电池器件短路电流密度,在氟掺杂二氧化锡(FTO)导电玻璃上构建SnO_(2)致密层,制备出SnO_(2)-TiO_(2)复合半导体薄膜。结构形貌测试表明,SnO_(2)-TiO_(2)复合半导体薄膜厚度略大于TiO_(2)半导体薄膜。电化学测试明确,SnO_(2)-TiO_(2)复合半导体薄膜能抑制FTO导电玻璃上电子与电解液中氧化还原电对之间的复合反应,有效提升了电池器件的短路电流密度。光电流密度-电压曲线证实基于SnO_(2)-TiO_(2)复合半导体薄膜的电池器件短路电流密度达到了17.53 mA/cm^(2),其光电转换效率为7.28%,高于基于TiO_(2)半导体薄膜的电池器件效率6.74%。

铝用TiB_2-C复合阴极炭块的开发与应用

介绍了一体化成型TiB2 -C复合层阴极炭块和TiB2 -C复合冷捣糊的研制、产品检测 ,在 75kA工业预焙槽上的应用试验以及经济效益与社会效益分析。

M16添加牛磺酸和EDTA支持昆明白小鼠体外受精并发育至囊胚

在以往研究工作的基础上证明了通过添加2.5mmol/L的牛磺酸和0.1mmol/L的EDTA至M16培养液中，可支持昆明白小鼠的体外受精（IVF），并支持受精卵突破2－细胞阻滞发育至囊胚期。本研究进一步证明了牛磺酸和EDTA在昆明小鼠早期胚胎发育和克服2－细胞阻滞中起关键作用。

小鼠早期胚胎的体外培养研究

目的 寻求一种体外稳定培养早期胚胎的方法。方法 比较了不同培养基 (M16、G1、CZB)从受精卵到囊胚的培养效果 ,并对CZB做了加糖与不加糖、加BSA与 15%FBS的比较研究。对体外形成的囊胚做细胞记数以评估胚胎的质量。结果 CZB无论加糖还是不加糖 ,均能有效克服 2 细胞阻滞 (70 0 %～ 84 6% ) ,加糖CZB囊胚形成率(46 1%～ 50 0 % )更高。受精卵一直在无糖CZB中培养与第 3d后转入加糖CZB培养的桑椹胚和囊胚形成率无显著性差异。CZB中加BSA和 15%FBS的培养效果相当。体外培养形成的囊胚较体内发育有迟滞现象 ,但是细胞记数无显著性差异。结论 对于昆明小鼠早期胚胎的体外培养 ,CZB是较M16、G1更适合的培养基 ,且CZB中从一开始就应该加糖。CZB中加BSA足可取代FBS 。

昆明系小鼠体外受精方法及一种新培养基的应用

目的：为研究受精卵早期发育机理提供大量、同步分裂的受精卵；寻找一种更好的受精卵体外培养基。方法：小白鼠超排取卵，附睾取精，建立体外受精模型。并比较不同培养液对受精卵发育的影响。结论：建立了昆明系小鼠的体外受精模型。受精２４ｈ后，Ｍ１６和ＫＳＯＭ分别有３１．５％和４８．７％发育到２－细胞期；受精４８ｈ后，则分别有１５．７％和５３．６％发育到４－细胞期。结论：ＫＳＯＭ在一定程度上克服“二细胞阻滞”

Pin1抑制剂对小鼠植入前胚体外发育的影响

目的观察Pin1在小鼠植入前胚中的定位分布及其抑制剂胡桃醌(Juglone)对小鼠植入前胚体外发育的影响。方法免疫荧光染色观察不同发育阶段植入前胚中Pin1的分布;收集小鼠1-细胞胚,以KSOM培养液为对照组,以培养液中添加有不同浓度的Juglone为实验组,观察各组1-细胞胚体外发育情况;Real-time PCR检测体外发育2-细胞胚内干细胞转录因子(Sox2、Oct4、c-Myc和Klf4)m RNA表达水平。结果小鼠不同发育阶段植入前胚中都存在Pin1的表达,胞质和胞核内均有分布,且核内荧光着色明显比胞质强;10μmol/L和25μmol/L胡桃醌持续作用93h(注射人绒毛膜促性腺激素后27h^120h)使1-细胞胚阻滞于2-细胞阶段,极少能过渡至4-细胞胚(P<0.01)。25μmol/L胡桃醌短时间作用18h(注射人绒毛膜促性腺激素后27~45h)同样使1-细胞胚发育阻滞于2-细胞胚(P<0.01);25μmol/L胡桃醌组2-细胞胚内Sox2 m RNA表达水平低于KSOM组(P<0.05),而Klf4、cMyc和Oct4 m RNA表达水平无明显变化(P>0.05)。结论小鼠1-细胞胚之后,Pin1主要定位在细胞核内,提示其可能参与细胞转录活动。且Pin1抑制剂(胡桃醌)能使2-细胞胚至4-细胞胚过渡率明显降低,并使干细胞转录因子Sox2 m RNA表达下调,提示Pin1在小鼠植入前胚早期发育阶段具有一定作用,其参与调控合子基因组激活与干细胞转录因子Sox2有关。

转sMTPGH基因小鼠胚胎的体外培养

采用纯化的羊金属硫蛋白 (s MT)启动子指导的猪生长激素 (PGH )基因 (s MTPGH)为显微注射片段 ,将其导入小鼠受精卵原核 ,比较了几种不同培养液对导入外源基因的小鼠胚胎体外发育的影响。结果表明 ,改进的 M16培养液(用 m M16表示 )能有效克服 2 -细胞阻断现象 ,并使转基因胚胎发育到桑椹胚或囊胚阶段。在 m M16培养液的基础上 ,再加入表皮生长因子 (EGF) ,可使 1-细胞胚胎发育到囊胚的比率进一步提高。在 3种培养液 (M16、m M16、m M16 +EGF)中 ,转基因胚胎突破 2 -细胞阻断期的比率分别为 12 %、6 8%、90 % ,发育到囊胚期的比率分别是 0 %、2 0 %、4 3%。采用 PCR方法检测 5 7枚经体外培养发育至囊胚的显微注射胚胎 ,4枚扩增出阳性条带 ,外源基因在囊胚期胚胎的滞留率为 7%。

p38在小鼠着床前胚胎中的表达(简报)(英文)

探讨p38 MAPK在小鼠着床前胚胎期的表达图式,并对其作用作初步分析。用免疫印迹法分析胚胎全裂解物中的p38蛋白。为考察p38在着床前发育中的作用,在胚胎培养液中添加p38专一性抑制剂SB203580。此外对同位素标记的胚胎作双向电泳分析,示踪ZGA(zygotic gene acti-vation,合子型基因激活)标志物TRC的表达情况。在卵母细胞中能检测到低水平的p38蛋白,而在合子中的检测度更低,表明p38是贮存于卵母细胞内的母型转录物,自减数分裂期随其它母型转录物一起逐步降解。到2细胞中期p38蛋白的表达量开始恢复,在4细胞时达到顶峰,在8细胞时又跌落。p38蛋白在2到4细胞期的表达量上升提示该蛋白在小鼠着床前胚胎发育中可能发挥一定作用。经与p38抑制剂SB203580共培养后的2细胞中期胚胎中仍能清晰检测到TRC,因而以TRC为标志的ZGA对SB203580不敏感。SB203580同样不能阻止胚胎发育到桑椹胚期。

影响体外鼠胚试验标准化的要素分析

不孕症已成为影响人类生殖健康的全球性问题,作为治疗不孕症的一种重要治疗手段,辅助生殖技术经过几十年的发展已经获得长足进步。辅助生殖技术用医疗器械产业快速发展,对此类产品进行风险管理,制定相应的安全性评价检测方法已势在必行。2016年行业标准YY/T 1434-2016《人类体外辅助生殖技术用医疗器械体外鼠胚试验》已经发布,本文就体外鼠胚试验中的关键节点和试验体系要素进行简要综述。

大川芎丸各成份对血管内皮细胞钙通道的阻滞作用

目的 从中药大川芎丸的药物成份中筛选出对钙通道有阻滞作用的有效成份。方法 选用脐静脉内皮细胞 ,以尼莫同为阳性对照 ,采用45Ca2 + 掺入法 ,就各药物成份对血管内皮细胞钙通道的阻滞程度进行比较。结果 CD1、T3 A、T3 B、T4A 4种成份对钙通道有明显阻滞作用 (P <0 .0 1)。

阻滞和非阻滞品系小鼠早胚体外培养的比较

收集阻滞品系昆明(Kunming,KM)小鼠和非阻滞品系B6C3F1小鼠受精卵,以及KM小鼠和B6C3F1小鼠交叉交配所得受精卵,进行体外培养,研究阻滞品系小鼠早胚体外发育阻滞原因。结果表明,卵母细胞内在因素对子一代早胚体外发育的能力影响较大,即体外培养是否发生2-细胞阻滞与卵母细胞有关。