2,3-丁二醇脱氢酶基因(BudC)过表达菌株的构建和初步鉴定

旨在过表达Bud C进而上调2,3-丁二醇(2,3-Butanediol,2,3-BD)的合成,通过基因工程手段构建整合载体p R1SW-Bud C,经PCR和酶切双重验证后将其电转化至产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)HD79。结果经卡那霉素筛选,获得一株菌株K.oxytoca HD79-01。以原始菌株为对照,摇瓶发酵检测2,3-BD含量和相关酶活,q RT-PCR检测Bud C表达差异,最终Bud C在HD79-01中转录水平的表达量为HD79的45.25倍(P<0.01)。摇瓶发酵显示2,3-BD的最高产量、转化率和生产强度分别提高了24.54%、10.97%、45.08%[分别为30.818±0.003 g/L、0.253±0.013 g/g、0.43±0.01 g/(L·h)],酶活提高了3.61倍(0.563±0.003 U/mg)。因此,2,3-丁二醇脱氢酶基因(Bud C)过表达菌株构建不仅成功的提高了2,3-BD的产量也为实现2,3-BD的工业化生产奠定基础。

外源添加乙酸对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)产2,3-丁二醇影响初探

为验证乙酸作为信号分子的作用,本研究分别将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W141上清液(对照组)、W141-07 (△aldh6)上清液及1.5 g/L乙酸添加至对数生长期的W141发酵液中,检测2,3-BD产量、乙酰乳酸合成酶(ILV2)及2,3-丁二醇脱氢酶(BDH1)酶活。结果表明:当添加1.5 g/L乙酸时,2,3-BD产量、ILV2和BDH1酶活性均达到最高,分别为3.01±0.04 g/L、1.41±0.03 U/mg和0.12±0.002 U/mg,且较其余两组相比差异极显著(P<0.01)。同时,测定3组条件下ilv2(24 h)和bdh1(60 h)基因的表达情况时发现,添加W141-07上清液后,ilv2和bdh1基因的表达量分别下调了31.6%和25.0%;而添加1.5 g/L乙酸后,ilv2和bdh1的表达量均发生上调,分别是对照组的4.38及1.24倍。表明乙酸可作为信号分子驱动相关基因的表达,进而提高2,3-BD产量。

产酸克雷伯氏菌乳酸脱氢酶基因敲除提高2,3-丁二醇产量

乳酸脱氢酶(LDH)是乳酸生成途径中的关键酶,敲除乳酸脱氢酶基因,理论上可以减少甚至消除乳酸的产生,提高2,3-丁二醇的产量和得率。该研究采用体外拼接方式构建乳酸脱氢酶基因的同源线性片段ldhL-Cmr-ldhR,将其电转化至Klebisella oxytoca HD79中,通过Red同源重组技术筛选敲除成功的重组菌株,经聚合酶链式反应(PCR)、荧光定量-聚合酶链式反应(FQ-PCR)及2,3-丁二醇产量检测验证。结果表明,重组菌株2,3-丁二醇产量为40.20 g/L、转化率为0.38 g/g和生产强度为0.48 g/(L·h),相比供试菌株分别提高了26.8%、11.8%和45.5%;而乳酸产量则由4.83 g/L下降至2.45 g/L,相比供试菌株降低了49.3%。该实验为后续进一步提高2,3-丁二醇的产量和扩大菌株选择范围奠定基础。

克雷伯肺炎杆菌2,3-丁二醇合成途径功能基因研究

克雷伯肺炎杆菌2,3-丁二醇合成相关基因形成bud操纵子,其中budB编码乙酰乳酸合成酶,budC编码丁二醇脱氢酶。除了bud操纵子中的基因外,在缬氨酸合成途径中ilvB和ilvI也编码乙酰乳酸合成酶,dhaD、gldA和acyI三个脱氢酶都报道具有丁二醇脱氢酶活性。但是这些基因编码的酶蛋白对菌株合成2,3-丁二醇的贡献并不清楚。本文分别构建了budB、ilvB、ilvI单突变株,和kp-ΔbudC-ΔdhaD-ΔgldA-Δacyl四基因突变株,通过批次发酵实验对这些菌株的生理特性进行了研究。结果显示ilvB和ilvI基因突变对于2,3-丁二醇合成无明显影响,而budB突变株丧失2,3-丁二醇合成能力,表明budB编码的酶蛋白是2,3-丁二醇合成途径中唯一的功能性乙酰乳酸合成酶。kp-ΔbudC-ΔdhaD-ΔgldA-Δacyl四基因缺失突变株合成2,3-丁二醇能力相较于kp-ΔbudC有所下降,但仍然能合成2,3-丁二醇,表明dhaD,gldA和acyI编码的酶蛋白对于2,3-丁二醇合成贡献微弱,同时表明细胞中具有丁二醇脱氢酶功能的醇脱氢酶种类较多。

大强度训练对大鼠红细胞糖酵解代谢及2,3-二磷酸甘油酸的影响

以大鼠为实验对象 ,研究 7周大强度跑台训练对大鼠红细胞糖酵解代谢及 2 ,3-二磷酸甘油酸浓度的影响。结果发现 :1 ) 7周的大强度训练能够明显提高大鼠红细胞内无氧代谢酶LDH活性及代谢底物葡萄糖的浓度 ,有利于促进糖酵解代谢 ;2 )大强度训练后的大鼠在一次性运动后 ,红细胞LDH活性在运动后 30min显著升高 ,HL浓度在运动后 30min有非常显著性升高 ,同时伴随葡萄糖浓度的明显下降。 3)大强度训练7周的大鼠在一次性大强度运动后 2 4h ,红细胞Pk和葡萄糖均恢复到原有水平 ,但LDH活性仍处于显著高水平。 4 )大强度训练 7周会造成红细胞内 2 ,3-二磷酸甘油酸浓度显著升高 ,有利于红细胞向组织释放氧气 ,但其一次性运动对 2 ,3-二磷酸甘油酸的影响 ,有待进一步的研究。

细菌3-羟基丁酮及氧化还原产物代谢的研究进展

3-羟基丁酮及氧化还原产物是重要的4碳平台化合物,以糖质原料为底物的生物法制备是当今研究与生产的主流。介绍了3-羟基丁酮及氧化还原产物2,3-丁二醇、丁二酮产生的主要细菌,这些细菌积累3-羟基丁酮及氧化还原产物的代谢途径,主要的代谢及调控方式,代谢关键酶:乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶、2,3-丁二醇脱氢酶的结构与功能等国内外研究进展;并对3-羟基丁酮及氧化还原产物细菌代谢、发酵制备的未来研究提出了展望。

几种生物学指标与生物强化系统降解效率的关系

针对炼油废水生物强化处理系统中有时存在的不稳定造成排水超标的问题,研究了SBR反应器中采用生物强化技术,其细菌数量、脱氢酶、邻苯二酚1,2-双加氧酶(C12O)和邻苯二酚2,3-双加氧酶(C23O)等关键生物学指标与污染物去除效率的综合对应关系,并运用ERIC-PCR技术研究了运行前后处理系统内微生物群落的变化.结果表明,投加菌剂的生物强化处理系统提高了细菌数量和酶活,使处理效率明显提高.生物强化系统中细菌数量及C23O酶活与污染物去除效率呈正相关关系,且微生物群落结构十分稳定.C12O为一种诱导酶,其酶活随污染物去除效率升高而降低.

自杀质粒同源重组技术敲除阴沟肠杆菌budC基因以提升乙偶姻的产率

为了研究阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae,E.cloacae)SDM的2,3-丁二醇脱氢酶(budC)基因对乙偶姻产生的影响,采用自杀质粒同源重组技术敲除该基因。根据E.cloacae SDM的budC基因序列设计引物,构建budC基因敲除质粒,然后将质粒转化进E.cloacae SDM中,根据表型筛选及PCR验证获得budC基因缺失菌株。进行发酵试验后,利用高效液相色谱检测乙偶姻产量。结果表明,目的基因budC敲除成功,与原始菌株相比,基因缺失菌株2,3-丁二醇的产量降低了76.34%,乙偶姻的产量提高了103.78%。budC基因的敲除阻断了乙偶姻进一步分解代谢产生2,3-丁二醇的途径,提高了乙偶姻的产量。该试验获得了E.cloacaeΔbudC突变株,为利用微生物法工业化生产乙偶姻奠定了基础。

代谢工程改造枯草芽孢杆菌发酵生产乙偶姻

乙偶姻是枯草芽孢杆菌的主要代谢产物,它作为一种食用香精,广泛应用于食品、烟草、化妆品、清洁剂、酒类等行业。本研究首先在不产芽孢的枯草芽孢杆菌(BSD1,阻断了芽孢的合成途径)中敲除了2,3-丁二醇脱氢酶(BDH)的编码基因bdh A、乳酸脱氢酶(LDH)的编码基因ldh和乙酸激酶的编码基因(ACK)ack A,随后克隆了来自菌株B.subtilis168的α-乙酰乳酸合成酶(ALS)和α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)基因als S和als D,并将其在上述敲除菌中过量表达,结果表明阻断副产物合成途径和加强乙偶姻合成途径关键酶的表达,会显著提高乙偶姻的产量,最终乙偶姻产量达到38.08 g/L,产率为0.45 g·L^(-1)·h^(-1),产率提高了约87.5%。