基于光谱法-图像灰度法高通量筛选高效固定CO_(2)的苯甲酸脱羧酶

目的:苯甲酸脱羧酶能够催化羧化反应固定CO_(2),为了获得高效的苯甲酸脱羧酶,需要利用高通量分子克隆与突变体筛选系统对产生的大量突变体进行筛选,因此建立、开发高效的筛选评价方法对于获得高羧化效率的突变体至关重要。方法:利用2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶催化邻苯二酚固定CO_(2)的反应体系,建立了光谱法-图像灰度法高通量筛选和评价固定CO_(2)的苯甲酸脱羧酶突变体。利用分光光度法在308 nm快速定量羧化产物2,3-二羟基苯甲酸。同时利用高效液相色谱(HPLC)法对分光光度法的测定结果进行了校正,确定了分光光度法估算的2,3-二羟基苯甲酸浓度与HPLC方法测定的准确浓度之间具有良好的线性关系(R^(2)=0.996)。利用HPLC-分光光度法的相关性可以获得实际样品中准确的2,3-二羟基苯甲酸浓度。利用Image J软件获得蛋白质标准品和突变体的灰度均值,根据灰度法定量蛋白质标准品的标准曲线计算突变体的蛋白质表达量。利用单位酶量催化邻苯二酚获得2,3-二羟基苯甲酸的浓度比较突变体的催化活性。结果:纯酶和粗酶体系下HPLC法测定的2,3-二羟基苯甲酸浓度与分光光度法测定的吸光度值的关系分别为C_(1)=0.500A_(1)-0.010(R^(2)=0.996)和C_(2)=1.458A_(2)+0.4319(R2=0.991)。从13个突变体中获得了两个正向突变体,羧化活性分别是WT的3.5倍和1.7倍。结论:基于光谱法-图像灰度法可以实现高通量筛选固定CO_(2)的苯甲酸脱羧酶,该方法可用于具有相似功能的苯甲酸脱羧酶对其他取代基的酚类和水杨酸类似物的底物选择性筛选。

Potentiometric Study of Dissociation Constants of Dihydroxybenzoic Acids at Reduced Ionic Strengths and Temperatures

The dissociation behavior of two dihydroxybenzoic acid isomers, 2,3-DHBA and 3,4-DHBA, at 281 K and 293 K was determined by potentiometric titrations in 0.01 M NaCl and 0.03 M NaCl. Results showed that the dissociation enthalpy for the carboxylic group in DHBA is close to zero, resulting in dissociation constants that do not vary appreciably with temperature, whereas the dissociation constants for the first hydroxyl group vary significantly with temperature. Increasing ionic strength was found to result in increased values for the second dissociation constant, whereas the effect on the first dissociation constant was less clear.

基于Biomek i7自动化工作站筛选高效固碳脱羧酶突变体的方法

【背景】2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶(2,3-dihydroxybenzoic acid decarboxylase,2,3-DHBD)能够催化CO_(2)与酚类化合物羧化生成芳香羧酸,为固定CO_(2)合成增值化学品提供一种新的策略。由于目前转化效率低,限制了其应用。【目的】提高酶的催化效率,建立基于Biomek i7自动化工作站的高通量筛选方法以期实现高效筛选高羧化活性的苯甲酸脱羧酶的突变体,并建立一个从突变体构建到其酶活筛选的标准方法。【方法】基于Biomek i7自动化工作站对来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的2,3-DHBD(2,3-DHBD_Ao)进行突变体定点半饱和突变、克隆挑选、培养及酶活检测,实现508个克隆的两轮筛选,并利用HPLC评估高通量筛选方法的准确性。【结果】确定了高通量筛选粗酶催化的脱羧及羧化反应体系和Biomek i7自动化工作站筛选流程,对508个克隆进行两轮筛选,得到13个正向突变,HPLC检测最终确定3个正向突变体,构建的文库阳性突变率为0.6%,获得羧化活性最高的突变体是野生型2,3-DHBD_Ao的120%。【结论】利用Biomek i7自动化工作站建立了高通量筛选高羧化活性脱羧酶的方法,首次将自动化高通量设备与突变体筛选结合,提供了筛选时评价指标的确定思路,经过175 h即可完成508个克隆的两轮筛选工作,相较于人工筛选,该方法缩短了筛选周期,具有快速、准确和高效的特点。