维生素C重要前体2,5-二酮基-D-葡萄糖酸发酵研究

从腐烂苹果、青椒等材料中分离出 6 78株菌 ,得到 1株菌A6经鉴定为葡萄糖酸杆菌(Gluconobactersp ) ,其发酵液分离提取产物经红外、紫外光谱、质谱、核磁共振和圆二色谱鉴定确证为 2 ,5 二酮基 D 葡萄糖酸。该菌的发酵条件研究表明 ,在含 2 5 %葡萄糖的玉米浆碳酸钙培养基中 ,2 8℃发酵 7d可生成 2 ,5 二酮基 D 葡萄糖酸 172 0mg/mL ,摩尔转化率为5 2 0 3%。在耐糖性方面高于国内同类报道。

D-葡萄糖串联发酵产生维生素C前体—2-酮基-L-古龙酸——I.产酸新菌株SCBl25产生中间体2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(盐)发酵条件的研究

维生素C(Vitamin C,简称Vc),又称L-抗坏血酸(L-Ascorbic acid)是人体必需的维生素,生理作用广泛,在医药和食品工业上均有重要地位。目前国内厂家多以我国发明的“二步发酵法”进行生产,即以D-山梨醇为原料生产2-酮基-L-古龙酸(以下简称2-KLG),然后制备维生素C。而近年来引起国内外普遍关注的是从D-葡萄糖串联发酵生产2-KLG的新工艺,以及采用基因工程技术,构建直接由D-葡萄糖转化生成2-KLG的基因工程菌的研究(图1)。1987年以来我国学者尹光琳等人采用了欧文氏菌(Erwinia sp.)和棒状杆菌(Corynebacterium sp.)进行串联发酵产生维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸,并开展了一系列的研究。

2,5-DKG还原酶Ⅱ基因的克隆和在大肠杆菌中的表达

参照文献上的2，5-二酮基-D-葡萄糖酸（简称2，5-DKG）还原酶II基因序列，合成两个引物序列并在两端加上EcoRI和BamHI两个酶切位点，抽提棒状杆菌SCB3058菌株的染色体为模板进行PCR反应，克隆得到2，5-DKG还原酶II基因，酶切验证与预期的结果相符合。将此片段克隆到pGEM-T载体上保存．将2，5-DKG还原酶II基因用EcoRI和BamHI内切酶切下，连接到pBV220载体上，构建成表达载体。42℃诱导不能得到稳定的蛋白表达条带和酶活力，测序发现基因的3’末端的原PCR引物外少合了一个碱基，终止密码子发生移码突变而消失。此外在5’端的启始密码子ATG前有三个碱基与pBV220载体上的SD序列发生配对。据此，重新设计和合成了PCR引物，并用pBV220和pBL4载体构建了两个表达载体。42℃诱导表达均得到了稳定的表达条带和较高的酶活力．

2,5-二酮基-D-葡萄糖酸产生菌株发酵条件研究

从腐烂苹果、青椒等材料分离得到一株葡萄糖酸杆菌 (Gluconobactersp .)A6 可将葡萄糖转化为 2 ,5 二酮基 D 葡萄糖酸。该菌的发酵条件研究表明 ,在含质量浓度 2 5 %葡萄糖的玉米浆碳酸钙培养基中 ,2 8℃发酵 7d可生成 2 ,5 二酮基 D 葡萄糖酸钙 172 0mg/mL ,转化率为摩尔比 5 2 0 5。

NAD-Sepharose6MB亲和胶的制备及在2,5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶纯化中的应用

目的 :制备NAD亲和胶 ,用于分离纯化 2 ,5 二酮基 D 葡萄糖酸还原酶。方法 :将NAD通过丁二酸二酰肼与溴化氰活化的Sepharose 6MB胶联结 ,制得NAD亲和胶。从棒杆菌细胞中提取的 2 ,5 二酮基 D 葡萄糖酸还原酶粗酶液用NAD亲和胶进行亲和层析纯化。结果 :NAD的结合率为 71.6 7% ;亲和层析回收率为 77.2 7% ;酶的比活提高了 1.1倍。结论 :以NAD为配基的亲和胶用于纯化以NADPH为辅酶的 2 ,5

D-葡萄糖串联发酵产生维生素C前体—2-酮基-L-古龙酸——Ⅱ.菌株SCB3058产生2-酮基-L-古龙酸发酵条件的研究

维生素C(Vitamin C,简称Vc),又称L-抗坏血酸(L-Ascorbic acid)是人体必需的维生素,生理作用广泛,在医药和食品工业上均有重要地位。目前国内厂家多以我国发明的“二步发酵法”进行生产,即以D-山梨醇为原料生产2-酮基-L-古龙酸(以下简称2-KLG),然后制备维生素C。而近年来引起国内外普遍关注的是从D-葡萄糖串联发酵生产2-KLG的新工艺,以及采用基因工程技术,构建直接由D-葡萄糖转化生成2-KLG的基因工程菌的研究(图1)。1987年以来我国学者尹光琳等人采用了欧文氏菌(Erwinia sp.)和棒状杆菌(Corynebacterium sp.)进行串联发酵产生维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸,并开展了一系列的研究。

从D-葡萄糖直接发酵产生维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸——Ⅰ.菌株的诱变选育和代谢产物的鉴定

2-酮基-L-古龙酸是合成维生素C的前体,以D-葡萄糖为原料经两种微生物串联发酵直接制备。本文报道了用紫外线照射和硝基胍处理等方法对2-酮基-L-古龙酸及其中间体2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(盐)产生菌的诱变选育。葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter sp.)SCB 611在含D-葡萄糖、玉米浆和碳酸钙的培养基中,经48小时培养后,可生成2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(盐)。同时也选出了一株欧文氏菌(Erwinia sp.)SCB 247,它的产酸能力比前者明显要高。棒状杆菌(Corynebacterium sp.)SCB 3058在以D-葡萄糖作为氢载体的情况下,经过三天摇瓶发酵,能将经SDS处理的2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(盐)有效地转化为2-酮基-L-古龙酸。上述菌株的代谢产物经分离提取后用熔点测定、元素分析、红外和紫外吸收光谱测定等鉴定,可以确证菌株SCB 611或(SCB 247)及菌株SCB 3058的代谢产物分别是2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(盐)和2-酮基-L-古龙酸。

氧化葡萄糖酸杆菌底物转化特性和与棒杆菌细胞共固定化合成2-酮基-L-古龙酸的研究

采用聚乙烯醇（ＰＶＡ）海藻酸钙包埋法制备固定化细胞，研究了氧化葡萄糖酸杆菌（ＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｏｘｙｄａｎｓＡＴＣＣ９９３７）固定化细胞的有关性质。该菌株休止细胞能优先利用葡萄糖酸为产酸底物合成２，５二酮基Ｄ葡萄糖酸，并以５％的总浓度为优。固定化细胞的使用稳定性和贮存稳定性均比游离细胞有明显增加，而且固定化细胞对ｐＨ值有较宽的适应范围。根据细菌合成２酮基Ｌ古龙酸的２，５二酮基Ｄ葡萄糖酸途径，用聚乙烯醇海藻酸钙包埋法将氧化葡萄糖酸杆菌和棒杆菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．ＡＴＣＣ３１０９０）休止细胞共固定化，以葡萄糖酸为初始原料，探讨了氧化葡萄糖酸杆菌和棒杆菌共固定化细胞合成２酮基Ｌ古龙酸的方法，最高转化率为３７．７２％。

葡萄糖直接发酵产2-酮基-L-古龙酸途径中代谢产物的HPLC分析

建立了利用高效液相色谱对葡萄糖发酵产2-酮基-L-古龙酸体系中的4种代谢产物D-葡萄糖酸、2-酮基-D-葡萄糖酸、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸和2-酮基-L-古龙酸的定量测定方法,分析条件为:300mm×7.8 mm AminexHPX-87H柱,柱温30℃,流动相为50mmol/L硫酸,流速0.2mL/min,RID-10A示差检测器,以丙二酸为内标物.结果表明,4种物质分离较好.该方法对2-酮基-D-葡萄糖酸、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸和2-酮基-L-古龙酸3种代谢物的检测平均误差分别为1.53%,0.89%和1.84%.