改良2-^(△△CT)法分析RNASET2基因在卵巢癌卡铂耐药中的表达

目的:建立改良的相对定量2^(-△△CT)法并应用其分析RNASET2基因在卵巢癌卡铂耐药细胞系中的差异表达。方法:分别提取卵巢癌卡铂耐药SKOV3细胞系与其亲本SKOV3细胞系的总RNA,将等量的mRNA逆转录为cDNA,应用实时荧光定量PCR(real-time RT-PCR)技术检测核糖核酸酶T2(RNASET2)基因在卵巢癌卡铂耐药中的差异表达,参照2^(-△△CT)公式的推导步骤,对其改良演化出一个新的公式即改良2^(-△△CT)公式。以绝对定量法为对照,应用该公式分析real-time RT-PCR技术检测结果并比较两种方法的差异。结果:改良2^(-△△CT)公式与绝对定量法分析实验结果差异无统计学意义(P>0.05)。卵巢癌卡铂耐药SKOV3细胞系RNASET2基因的表达相对于卵巢癌非耐药SKOV3细胞系的表达降低。结论:改良2^(-△△CT)公式分析real-time RT-PCR反应数据是一种简便可行的相对定量方法,RNASET2表达下调与卵巢癌卡铂耐药相关。

不同引物及数据分析方法对定量PCR结果的影响

目的:研究不同引物及数据分析方法对实时荧光定量PCR SYBR Green染料法检测基因表达差异结果分析的影响。方法:通过Primer Express 2.0软件对目的基因CCND1、C-JUN分别设计4对不同引物进行SYBR Green染料法定量PCR扩增,并分别使用2-△△CT法、Pfaffl法及相对标准曲线法计算肺癌紫杉醇敏感细胞株及耐药细胞株间目的基因的表达差异,分析不同引物和数据计算方法对实验结果的影响。结果:统计学分析表明,引物的扩增效率对定量PCR结果分析有显著影响,不同引物特异性扩增得到的样本间表达倍数有显著差异(P<0.05)。3种计算方法中,Pfaffl法与相对标准曲线法无统计学差异(P>0.05),而2-△△CT法与其他2种方法均有显著差异(P<0.05)。结论:引物的选择对于定量PCR结果有显著影响;Pfaffl法是更准确,更合理的相对定量计算方法。

亚洲韧皮杆菌在单株脐橙病树的分布情况

【目的】研究亚洲韧皮杆菌(CLas)在纽荷尔脐橙病树的分布情况,为柑橘黄龙病(HLB)的防控提供参考依据。【方法】以1~3个枝条表现斑驳黄化叶片症状的纽荷尔脐橙病树为研究对象,对主干发出的5个主枝(A、B、C为斑驳黄化枝条,D、E为无症状枝条)的叶片分别取样,运用PCR和实时荧光定量PCR(qPCR)分别检测,用2^(-ΔΔCr)法分析树体各部分黄龙病菌含量。对于果树上表现典型HLB病果但叶片无症状的结果枝,分别检测典型病果和相应叶片的感病情况。【结果】PCR对A、B、C、D、E的阳性检出率分别为88.57%、61.11%、54.17%、6.67%和0,qPCR对A、B、C的阳性检出率均为100.00%,对D、E的阳性检出率分别为40.00%和13.33%;2^(-ΔΔCr)法分析发现,斑驳黄化叶片中病原菌含量更高,病果的阳性检出率高于相应的无症状叶片样品。【结论】CLas在表现典型斑驳黄化症状的叶片和果实中的含量及阳性检出率均较高,病原菌在病树中分布不均匀。在进行HLB检测时,应选取典型或疑似症状样品,并运用qPCR进行检测,一旦发现树体局部发病,应当整株销毁。